中國狂犬病毒時(shí)空動(dòng)力學(xué)及其與狂犬病疫情的關(guān)系.pdf

1、[研究背景]
　　 狂犬病是由狂犬病毒引起的人畜共患病,表現(xiàn)為急性、進(jìn)行性、幾乎不可逆轉(zhuǎn)的腦脊髓炎。該病宿主動(dòng)物廣泛、呈世界性分布。中國是世界上僅次于印度的狂犬病第二高發(fā)國家。從1996年至今,中國的狂犬病疫情進(jìn)入新的流行高峰,2007年中國狂犬病疫情達(dá)到頂峰,全國報(bào)告病例3302例。與此同時(shí),狂犬病地理分布的范圍和宿主動(dòng)物的種類也逐步擴(kuò)大和增加。全國31個(gè)省(直轄市)中除西藏、青海之外均有狂犬病疫情的報(bào)告,近幾年野生動(dòng)物傷人引

2、發(fā)狂犬病的報(bào)告也逐步增多。盡管狂犬病在中國已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題,但與狂犬病流行密切相關(guān)的諸多理論和實(shí)際問題并沒有得到很好的研究。近年來雖有不同的學(xué)者開展了狂犬病分子流行病學(xué)的研究,但多數(shù)局限于系統(tǒng)發(fā)生分析。因此,本研究在全國狂犬病主要流行區(qū)的七個(gè)省(直轄市)收集宿主動(dòng)物的腦組織標(biāo)本并進(jìn)行狂犬病毒核蛋白基因測序,利用核蛋白核苷酸序列進(jìn)行了包括系統(tǒng)發(fā)生分析、空間動(dòng)力學(xué)分析和種群歷史分析的綜合的分子流行病學(xué)研究。本研究從分子水平上了解中國

3、狂犬病毒的時(shí)空分布特征、分布分化機(jī)制,探討其與病毒流行、擴(kuò)散的內(nèi)在聯(lián)系,為有效地預(yù)防和控制狂犬病在我國的蔓延提供科學(xué)依據(jù)。
　　 [研究目的]
　　 1.了解中國狂犬病毒N基因遺傳變異特點(diǎn)和進(jìn)化特征,為研究其與病毒毒力的關(guān)系提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　 2.研究中國狂犬病毒間系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系,描述中國狂犬病毒的時(shí)空分布特征。
　　 3.研究中國狂犬病毒的分布分化機(jī)制,探討其在中國的播散方式和路徑。
　　 4.

4、重構(gòu)中國狂犬病毒的進(jìn)化歷史和種群動(dòng)態(tài),探討其與疫情流行和擴(kuò)散的關(guān)系,為有效地預(yù)防和控制狂犬病在我國的蔓延提供科學(xué)依據(jù)。
　　 [研究方法]
　　 1.疫情資料的整理和分析
　　 狂犬病疫情資料來自于中國疾病預(yù)防控制中心疾病監(jiān)測信息系統(tǒng)。通過Excel對疫情資料進(jìn)行整理、分析,了解1996-2008年中國狂犬病流行特征。
　　 2.標(biāo)本的采集、檢測和測序
　　 本研究在覆蓋中國狂犬病主要流行區(qū)的7個(gè)

5、省、直轄市收集動(dòng)物(犬、貓)的腦組織標(biāo)本。利用直接免疫熒光法(DFA)和RT-PCR法對標(biāo)本進(jìn)行抗原和核酸檢測,獲得陽性標(biāo)本。利用PCR方法對陽性標(biāo)本進(jìn)行N基因編碼區(qū)核苷酸序列的擴(kuò)增和測序,獲得完整的N基因核苷酸序列。
　　 3.構(gòu)建Lyssavirus基因序列信息數(shù)據(jù)庫
　　 下載Genbank上所有Lyssavirus序列信息,以PostgreSQL交互式數(shù)據(jù)庫為平臺(tái),利用Perl編程語言編制腳本程序,構(gòu)建包含序列信

6、息、流行病學(xué)信息等的Lyssavirus基因序列信息數(shù)據(jù)庫,并利用SQL語言實(shí)現(xiàn)對數(shù)據(jù)的輸入、更新、查詢、下載等應(yīng)用。
　　 4.序列的整理和分析
　　 (1)序列的整理
　　 測序結(jié)果用ATGC軟件拼接后,ClustalX軟件進(jìn)行完全比對；BioEdit軟件進(jìn)行序列的分析和剪切。DNAStax(5.01)軟件中MegAlign分別進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列間同源性比較；GeneDoc軟件制成核苷酸及氨基酸差異顯示圖

7、。
　　 (2)系統(tǒng)發(fā)生分析
　　 利用本次試驗(yàn)獲得的34條序列和GenBank中的中國代表序列的N基因構(gòu)造系統(tǒng)發(fā)生樹。首先用Modeltest檢驗(yàn)數(shù)據(jù),獲得最適模型(HKY)和各種參數(shù)值；然后利用PHYLIP軟件包的最大似然法(ML)構(gòu)建特征法系統(tǒng)發(fā)生樹,bootstrap值設(shè)定為100。
　　 (3)空間動(dòng)力學(xué)分析
　　 對選自中國狂犬病主要流行區(qū)的具有明確分離地點(diǎn)的221條N基因序列,利用PAUP的

8、最大簡約法(MP)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,結(jié)果保存為不帶分支長度的無根樹；同時(shí)用a-z單個(gè)字母來表示每條序列的分離地點(diǎn),再利用MigraPhyla和PAUP的MP法計(jì)算遷移事件距離矩陣。
　　 利用UniFrac,以帶分支長度的有根樹和表明分離地點(diǎn)的序列名字作為輸入文件,進(jìn)行主成分PCA(Principal component analysis)分析。根據(jù)分析結(jié)果判定不同環(huán)境(省份)之間的、在進(jìn)化上的距離、異質(zhì)性,同時(shí)繪制三維空間矩陣。

9、
　　 (4)種群動(dòng)態(tài)與進(jìn)化歷史分析
　　 基于蒙特卡洛馬爾科夫鏈(MCMC)隨機(jī)算法,利用BEAST軟件對選擇的有明確分離年代的我國211條N基因序列進(jìn)行堿基替換速率、最近共祖先(Tmrca)、種群增長模型和skyline plot分析。根據(jù)Modeltest分析結(jié)果選擇HKY模型,分別選擇嚴(yán)格分子鐘(strict clock)和松弛分子鐘(relaxed clock)模型下的三種種群增長模型-常數(shù)模型(constan

10、t population size)、指數(shù)模型(exponential growth)、對數(shù)模型(logistic growth),并計(jì)算各參數(shù)值和likelihood值。利用likelihood值進(jìn)行比較,確定種群的增長模型和各參數(shù)的值。
　　 [結(jié)果]
　　 1.本研究在廣西、貴州、山東、安徽、浙江、江蘇、上海收集動(dòng)物腦組織標(biāo)本987份,經(jīng)DFA和RT-PCR法檢測后共獲得陽性標(biāo)本34份。對34份標(biāo)本進(jìn)行N基因編碼區(qū)

11、核苷酸序列的擴(kuò)增和測序,獲得長度為1353bp的完整的N基因核苷酸序列。
　　 2.基因序列同源性分析顯示,34個(gè)病毒標(biāo)本N基因的1353個(gè)核苷酸序列同源性為88.9％-100％,推導(dǎo)的氨基酸序列(N蛋白212-450位)同源性為97.6％-100％,說明N基因核苷酸序列的變異主要是同義突變。N蛋白四個(gè)抗原位點(diǎn)及Th細(xì)胞表位都高度保守。
　　 3.ML系統(tǒng)發(fā)生樹顯示:中國狂犬病病毒形成四個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支(CladeⅠ-C

12、ladeⅤ),每個(gè)分支又可細(xì)分為不同的進(jìn)化群。其中CladeⅠ和CladeⅡ包含近年來分離的多數(shù)毒株,為優(yōu)勢分支。每個(gè)進(jìn)化分支同時(shí)具有地域分布和不同地區(qū)毒株混合特征。
　　 4.87％的配對地點(diǎn)間沒有發(fā)生遷移事件。中國狂犬病毒存在分別以江蘇、上海和湖南為中心的東部和西南部兩個(gè)循環(huán)圈。白面鼬狂犬病毒存在從江西向浙江的傳播。
　　 5.基于馬爾科夫鏈的貝葉斯分析顯示,CladeⅠ和CladeⅡ分別起源于1992和1960前后

13、,進(jìn)化速率分別為:1.274×10-3(CI95％:8.3705-4-1.2515E-3)和9.629×10-4(CI95％:3.519-4-1.628E-3)。CladeⅠ和CladeⅡ的最適種群模型均為分別為指數(shù)模型(exponential population growth)和常數(shù)模型(constant population size)。
　　 6.CladeⅠ的基因多樣性在從1994年開始到1996年上升迅速然后維持穩(wěn)定

14、期,隨后在2001-2003年又形成一個(gè)快速上升期,并在2003年達(dá)到最高。2004-2005年經(jīng)歷了迅速下降并維持平緩下降的趨勢。CladeⅡ基因多樣性一直維持穩(wěn)定的狀態(tài),2000年起到2003年經(jīng)歷快速上升,然后2004明顯下將并在2005年前后下降至最低點(diǎn)后維持穩(wěn)定狀態(tài)。
　　 [結(jié)論]
　　 1.N基因具有高度保守的特性,可能與其結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)。
　　 2.目前中國四個(gè)進(jìn)化分支的狂犬病毒(CladeⅠ

15、-CladeⅣ),已形成廣泛的地理分布。其分布分化同時(shí)存在著地理分散和遷移事件(即基因漂移)兩種機(jī)制,其中地理分散為中國狂犬病毒播散的主要方式。
　　 3.CladeⅠ狂犬病毒起源于1992年,在1994-1996和2001-2003期間以湖南為中心發(fā)生廣泛的地理分散,并于2004-2008年尤其是2004-2005年在華東地區(qū)以江蘇為中心發(fā)生遷移事件。
　　 4.CladeⅡ狂犬病毒起源于1960年,在2000-200