單鏈抗體介導(dǎo)狂犬病毒shRNA靶向制劑的研究.pdf

1、狂犬病是由狂犬病病毒引起的一種動(dòng)物源性人獸共患傳染病，病死率極高，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，我國(guó)是狂犬病流行最嚴(yán)重的國(guó)家之一。人被帶狂犬病毒的犬咬傷后，控制的基本策略是暴露后治療（Post exposure treatment，PET），高危暴露（Ⅲ級(jí)）時(shí)，WHO推薦使用抗狂犬病免疫球蛋白作為被動(dòng)免疫制劑。動(dòng)物源免疫球蛋白可能導(dǎo)致輕重不等的過(guò)敏反應(yīng)，而人抗狂犬病免疫球蛋白又有傳播血液疾病的危險(xiǎn)。因此，尋找有效和特異的治療狂犬病的新方法顯得十

2、分重要。
　　 RNA干擾（RNA interference，RNAi）是內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA（doublestranded RNA，dsRNA）誘導(dǎo)的mRNA水平的基因表達(dá)沉默現(xiàn)象，將21～23nt的干擾性雙鏈小RNA（short interfering RNA，siRNA）導(dǎo)入目的細(xì)胞，可以誘導(dǎo)高效且特異的RNAi效應(yīng)。目前，RNAi已經(jīng)成為替代基因敲除技術(shù)進(jìn)行基因功能研究的有力工具。隨著RNAi機(jī)制及其應(yīng)用研究的不斷深

3、入，在癌癥和一些病毒性疾病如艾滋病、乙型肝炎等，用siRNA治療研究已進(jìn)入一期或二期臨床試驗(yàn)，有望成為新型的治療制劑。
　　 RNA干擾可由人工合成雙股siRNA或者將表達(dá)shRNA（small hairpin RNA，shRNA）的載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，在Dicer酶作用下，shRNA被加工成siRNA。由于體外合成的siRNA導(dǎo)入機(jī)體后易被降解，而shRNA良好的重復(fù)性和較長(zhǎng)的細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)期，價(jià)格經(jīng)濟(jì)，也是以siRNA進(jìn)行基因治療的

4、首選方式。所以本研究選擇以質(zhì)粒載體表達(dá)shRNA進(jìn)行靶向藥物效果評(píng)價(jià)。
　　 治療性小干擾RNA面臨最大的問(wèn)題是在體內(nèi)安全運(yùn)送而不被RNA酶、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的滯留作用、腎臟代謝等復(fù)雜的體內(nèi)降解消耗機(jī)制作用而減少或消失，目前解決這個(gè)難題的有效方法之一是將siRNA用能識(shí)別感染細(xì)胞表面特異受體的蛋白與siRNA作用，將siRNA包裹起來(lái)，既保護(hù)了siRNA又使其實(shí)現(xiàn)靶向運(yùn)送。體內(nèi)細(xì)胞類(lèi)型特異性的基因沉默可以通過(guò)siRNA與細(xì)胞類(lèi)型特異性親和

5、配體或單克隆抗體結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。即抗體指導(dǎo)的siRNA復(fù)合物通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入靶細(xì)胞，隨后釋放到細(xì)胞漿，通過(guò)RNA干擾路徑，特異性地沉默靶基因的表達(dá)?？贵w成份與小核酸分子結(jié)合后能在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)有效運(yùn)送siRNA。已在體內(nèi)證明了這種運(yùn)送方式不使機(jī)體產(chǎn)生特異免疫反應(yīng)和毒性，成為有前景的治療性方法。
　　 本研究以針對(duì)人源狂犬病毒G糖蛋白二硫鍵穩(wěn)定單鏈抗體（single chaindisulfide-stabilized antibody，sc

6、dsFv）來(lái)特異識(shí)別感染細(xì)胞表面出芽的狂犬病毒，用綠膿桿菌外毒素跨膜區(qū)ETA部分實(shí)現(xiàn)穿膜，以酵母DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域GAL4與含有特異shRNA的質(zhì)粒結(jié)合，制備了狂犬病毒靶向藥物，并對(duì)該藥物在體內(nèi)外抑制RV的復(fù)制情況進(jìn)行了探索，以期為狂犬病暴露后乃至發(fā)病后的治療積累必要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 本研究針對(duì)狂犬病毒N蛋白編碼基因，設(shè)計(jì)合成了4對(duì)shRNA，以隨機(jī)序列shRNA為陰性對(duì)照，將shRNA分別連接到表達(dá)載體pRNATU6.3上，轉(zhuǎn)

7、染BHK-21細(xì)胞后，在潮霉素抗性壓力下，篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)shRNA的BHK-21細(xì)胞株。在體外檢測(cè)其對(duì)狂犬病毒標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒CVS-11的抑制效果，用直接免疫熒光、熒光定量PCR、Western blot檢測(cè)表明，篩選出具有高效抑制RV復(fù)制的2個(gè)靶位點(diǎn)N-489和N-701。
　　 為獲得能良好識(shí)別RV感染細(xì)胞的單鏈抗體，根據(jù)已發(fā)表的具有廣譜中和效力的人源RV G單抗序列，設(shè)計(jì)點(diǎn)突變位點(diǎn)，人工合成scdsFv序列，連接到pET-2

8、2b（+）載體上，經(jīng)大腸桿菌表達(dá)，獲得包涵體表達(dá)的scdsFv蛋白。親和力、特異性和中和能力檢測(cè)表明該scdsFv具有特異識(shí)別狂犬病毒感染細(xì)胞的能力。
　　 為了制備能與含shRNA的質(zhì)粒載體結(jié)合的具有導(dǎo)向作用的嵌合蛋白，設(shè)計(jì)引物從質(zhì)粒PE40-GAL4-T上擴(kuò)增獲得了綠膿桿菌外毒素穿細(xì)胞膜區(qū)-酵母DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域ETA-GAL4基因，將ETA-GAL4、scdsFv通過(guò)搭橋PCR，獲得了scdsFv-ETA-GAL4基因，即S

9、EG，在原核表達(dá)載體pET28a中表達(dá)了融合蛋白SEG。此蛋白以包涵體表達(dá)為主，經(jīng)包涵體變性、Ni-柱純化、復(fù)性后獲得有活性SEG蛋白，實(shí)驗(yàn)表明此融合蛋白明顯保留有抗原結(jié)合活性，可特異結(jié)合細(xì)胞膜上的病毒抗原。
　　 SEG可以結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)shRNA到狂犬病毒感染細(xì)胞。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表明，SEG蛋白具有與shRNA結(jié)合的能力，且這種結(jié)合存在著劑量依賴(lài)關(guān)系:1nM SEG可以結(jié)合約10nM shRNA；綠色熒光蛋白（GFP）顯示SE

10、G蛋白可將含shRNA的質(zhì)粒特異性運(yùn)送到病毒感染的細(xì)胞。MTT檢測(cè)表明SEG-shRNA復(fù)合物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有毒性作用。在感染細(xì)胞中，病毒RNA水平和蛋白水平檢測(cè)結(jié)果均表明，SEG靶向轉(zhuǎn)運(yùn)shRNA能夠有效地抑制病毒的復(fù)制。
　　 在小鼠后肢肌肉注射CVS-24毒以制備動(dòng)物模型。在小鼠感染模型中，取50LD50 RV標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒CVS-24攻毒后，尾靜脈注射SEG-shRNA復(fù)合物，進(jìn)行狂犬病毒的體內(nèi)靶向效應(yīng)試驗(yàn)。結(jié)果顯示，靶向藥物

11、SEG-shRNA注射后30h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明僅在注射病毒的右側(cè)后腿肌肉檢測(cè)到GFP，其余組織和內(nèi)臟器官均無(wú)GFP表達(dá)。表明此復(fù)合物在體內(nèi)可實(shí)現(xiàn)靶向性運(yùn)送。小鼠保護(hù)性試驗(yàn)表明，注射病毒后8h尾靜脈注射SEG-shRNA，5d后檢測(cè)小鼠腦內(nèi)RV含量：RT-PCR、Western blot檢測(cè)表明使用靶向藥物組RV含量明顯少于病毒對(duì)照組，條帶亮度變?nèi)?；qRT-PCR表明靶向藥物組比病毒對(duì)照減少4.88倍；小鼠發(fā)病時(shí)間比病毒對(duì)照組晚48h