狂犬病毒的電鏡檢測及其糖蛋白基因的克隆與序列分析.pdf

1、狂犬病毒(Rabies Virus，RV)屬于彈狀病毒科(Rhabdoviriade)，狂犬病毒屬(Lyssavirus)。在電鏡下其外形具有明確子彈狀形態(tài)特點，易于辨認(rèn)。因此，電鏡檢查為狂犬病毒的形態(tài)鑒定提供了快速直觀的診斷。狂犬病毒的糖蛋白是病毒粒子的重要成份，具有血凝活性，為病毒粒子與宿主細(xì)胞結(jié)合的受體位點提供橋梁，是唯一能產(chǎn)生中和抗體的病毒成分，它能影響狂犬病疫苗的免疫原性。本實驗對狂犬病毒進(jìn)行了電鏡檢測，旨在分析其形態(tài)特征，為

2、狂犬病毒的診斷提供依據(jù)，并探討了電子顯微鏡技術(shù)在病毒學(xué)研究中的應(yīng)用。同時對狂犬病毒糖蛋白進(jìn)行克隆與序列分析，為其基因工程疫苗的開發(fā)、基因免疫等提供科學(xué)研究基礎(chǔ)。 本實驗采用電鏡負(fù)染技術(shù)、超薄切片法、高速離心等制樣方法，通過電鏡觀察對狂犬病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)、粒子大小、增殖方式、病毒在組織中的分布等進(jìn)行了分析。根據(jù)GenBank發(fā)表的狂犬病毒糖蛋白核苷酸序列，利用Oliga軟件設(shè)計兩對特異性引物，通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR

3、)擴(kuò)增了狂犬病毒 Flury-lep糖蛋白的全長 cDNA，將其插入克隆載體pMD-18T并測序。 結(jié)果表明：①在透射電子顯微鏡下狂犬病毒粒子呈顯著的子彈狀；②在掃描電子顯微鏡下觀察到狂犬病毒能與鵝紅細(xì)胞產(chǎn)生凝集反應(yīng)，且附著在鵝紅細(xì)胞表面；⑨測序結(jié)果及同源性分析表明，糖蛋白cDNA長1574bp，編碼524個氨基酸。狂犬病毒株 Flury-lep的GP基因序列與 GenBank 公布的狂犬病毒株GP基因片段核苷酸序列的同源性為8

4、2.3％～96.3％，其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列同源性為88.4％～94.3％。 通過本實驗，證明通過電鏡技術(shù)對狂犬病毒的鑒定是可行的、有效的，為以后的病毒鑒定提供了快速的鑒定方法。在沒有陽性血清或抗體的情況下，結(jié)合臨床癥狀、流行病學(xué)調(diào)查研究及電鏡技術(shù)可對病毒定性。本實驗對狂犬病毒Flury-lep株的GP基因成功地進(jìn)行了克隆與測序，為狂犬病毒分子流行病學(xué)的研究、選擇抗原性強(qiáng)的疫苗毒株和基因工程疫苗的研制提供了理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)，并