脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白疫苗預(yù)防高脂喂養(yǎng)小鼠胰島素抵抗及動(dòng)脈粥樣硬化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[背景]
　　 隨著社會(huì)的不斷發(fā)展和人們生活方式的改變，大量脂肪攝入所引發(fā)的肥胖及其相關(guān)代謝性疾病尤其是2型糖尿病的發(fā)病率正逐年上升，嚴(yán)重危害著人民群眾的身心健康。肥胖和糖尿病可能帶來(lái)一系列生理功能的改變，其大血管并發(fā)癥如動(dòng)脈粥樣硬化更是直接威脅生命，從而加重任何原因引致死亡的風(fēng)險(xiǎn)。傳統(tǒng)治療方法如控制飲食、加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)、內(nèi)科藥物及外科手術(shù)等，均或多或少存在著難以堅(jiān)持、依從性差、手術(shù)并發(fā)癥和遠(yuǎn)期效果不明確等種種弊端。因此，對(duì)于上述疾病

2、的治療還需另辟蹊徑。
　　 目前已有大量研究證據(jù)表明，脂肪組織除了儲(chǔ)存能量之外，還是一個(gè)重要的內(nèi)分泌器官，能夠釋放大量生物活性物質(zhì)入血，并通過(guò)局部和全身作用，協(xié)調(diào)能量代謝、胰島素敏感性、炎癥和血管反應(yīng)。脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(A-FABP，又稱FABP4，ap2)就是其中的一種，它屬于脂肪酸結(jié)合蛋白大家族，主要存在于脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，也可以分泌入血，其主要作用是參與游離脂肪酸及其它類型的脂質(zhì)激素的轉(zhuǎn)運(yùn)和合成，從而調(diào)節(jié)全身胰島

3、素敏感性及能量代謝活動(dòng)，并且在巨噬細(xì)胞中調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子和膽固醇酯的聚集。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究已經(jīng)證實(shí)，F(xiàn)ABP4水平與肥胖和糖脂代謝紊亂相關(guān)的多種病理狀態(tài)如高血糖、高胰島素血癥、高脂血癥、代謝綜合征、動(dòng)脈粥樣硬化等的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，F(xiàn)ABP4基因敲除或口服其特異性抑制劑的小鼠，表現(xiàn)出幾乎能夠完全抵抗飲食性或遺傳性肥胖誘導(dǎo)下的胰島素抵抗、血脂紊亂、動(dòng)脈粥樣硬化、脂肪性肝病等。
　　 因此，研究者們認(rèn)為，從某種程度上抑制F

4、ABP4的表達(dá)和作用，能夠有效改善外周的胰島素抵抗，保護(hù)胰島β細(xì)胞功能，而且對(duì)糖脂代謝和大血管病變產(chǎn)生有益的效應(yīng)，它可能成為肥胖、糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化治療的新靶點(diǎn)。然而，基因敲除技術(shù)難度高且可行性差，口服抑制劑同樣存在難以堅(jiān)持、依從性差等問(wèn)題。
　　 [目的]
　　 基于上述理論和實(shí)踐基礎(chǔ)，本研究以與機(jī)體糖脂代謝密切相關(guān)的蛋白FABP4為靶點(diǎn)，擬構(gòu)建能夠誘導(dǎo)出針對(duì)FABP4特異性中和抗體的治療性疫苗，主動(dòng)免疫高脂喂養(yǎng)下小

5、鼠，觀察免疫效果及其安全耐受性，為高脂誘導(dǎo)下胰島素抵抗及其大血管病變并發(fā)癥的預(yù)防及治療新途徑提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 [方法]
　　 1、采用生物合成的方法表達(dá)得到純化的小鼠FABP4蛋白作為一種蛋白疫苗，為了增加其免疫原性，另選取兩種不同的載體與之組成另兩種蛋白疫苗，分別是：(1)、以乙肝病毒核心抗原病毒樣顆粒(HBc-VLP)為載體的HBc-FABP4蛋白疫苗；(2)、以鑰孔戚血藍(lán)蛋白(KLH)為載體的KLH-FA

6、BP4蛋白疫苗。
　　 2、分別以三種不同的蛋白疫苗(實(shí)驗(yàn)組)及其相應(yīng)載體或佐劑(對(duì)照組)對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，觀察小鼠安全耐受性，同時(shí)摸索最佳免疫劑量和免疫間隔，通過(guò)ELISA法檢測(cè)各組FABP4抗體滴度以篩選出最佳免疫方案。
　　 3、選取方法2中篩選出的最佳免疫方案，對(duì)高脂喂養(yǎng)下野生型小鼠進(jìn)行免疫，并以其相應(yīng)載體或佐劑為對(duì)照，測(cè)量小鼠體重、攝食量、血糖、胰島素、脂聯(lián)素等指標(biāo)，并進(jìn)行葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)；處死小鼠后，取肝臟組織進(jìn)

7、行油紅O染色，比較肝臟脂肪沉積面積。
　　 4、選取方法2中篩選出的最佳免疫方案，對(duì)高脂喂養(yǎng)下載脂蛋白E(ApoE)敲除的小鼠(ApoE-/-)進(jìn)行免疫，并以其相應(yīng)的載體或佐劑為對(duì)照，測(cè)量小鼠體重、攝食量、血糖、胰島素、脂聯(lián)素、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、游離脂肪酸(FFA)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)等糖脂代謝相關(guān)指標(biāo)，并進(jìn)行葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)；處死小鼠后，分離小鼠主動(dòng)脈進(jìn)行油紅O染色，比較動(dòng)脈粥樣斑塊

8、面積。
　　 [結(jié)果]
　　 1、采用生物合成的方法，成功表達(dá)了純化的FABP4蛋白和對(duì)照組所需的免疫重組HBc蛋白，制備了攜帶FABP4抗原序列的HBc-FABP4蛋白疫苗，經(jīng)western-blot驗(yàn)證確實(shí)為所需蛋白；采用化學(xué)耦聯(lián)的方法，成功制備了KLH-FABP4蛋白疫苗。為進(jìn)一步的小鼠免疫打下了良好基礎(chǔ)。
　　 2、三種候選蛋白疫苗分別免疫小鼠后，均可產(chǎn)生FABP4特異性抗體，而作為對(duì)照的HBc組、KLH

9、組和佐劑組則沒(méi)有FABP4特異性抗體的產(chǎn)生，說(shuō)明這三種蛋白疫苗均能夠打破宿主對(duì)自身對(duì)FABP4的免疫耐受。其中，F(xiàn)ABP4組小鼠產(chǎn)生的抗體滴度最高，優(yōu)于HBc-FABP4組和KLH-FABP4組(P<0.05)。免疫間隔3周為有效的間隔時(shí)間，各組抗體滴度于第3輪加強(qiáng)免疫后達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)。免疫過(guò)程中，各組均有部分小鼠存在免疫接種局部輕度脫毛和皮下硬結(jié)現(xiàn)象，無(wú)其他顯著不良事件及死亡發(fā)生。
　　 3、選取最佳免疫方案(FABP4)對(duì)高脂

10、喂養(yǎng)野生型雌性和雄性C57BL/6J小鼠分別進(jìn)行免疫，產(chǎn)生了高滴度的FABP4特異性抗體。雌性：到首次免疫后第16w，疫苗組小鼠體重雖高于正常對(duì)照組，但明顯低于同樣高脂飲食的佐劑組(P<0.05)；疫苗組小鼠日平均攝食量明顯高于正常組(P<0.05)，但與佐劑組無(wú)差異(P>0.05)；疫苗組空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR指數(shù)、腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)曲線下面積均明顯低于佐劑組(P<0.05)，血清脂聯(lián)素水平高于佐劑組(P<0.05)，與

11、正常對(duì)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。雄性：到首次免疫后第16w，疫苗組小鼠體重明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)，與佐劑組未見(jiàn)明顯差別(P>0.05)；疫苗組日平均攝食量與其余兩組未見(jiàn)明顯區(qū)別(P>0.05)；疫苗組空腹血糖、腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)曲線下面積低于佐劑組(P<0.05)，血清脂聯(lián)素水平高于佐劑組(P<0.05)，與正常組無(wú)明顯差異(P>0.05)；疫苗組空腹胰島素、HOMA-IR指數(shù)高于正常組但明顯低于佐劑組(P<0.05)。

12、肝臟切片可見(jiàn)疫苗組脂肪陽(yáng)性面積和積分光密度(IOD)較空白對(duì)照組高，但明顯低于佐劑組(P<0.05)。
　　 4、選取最佳免疫方案(FABP4)對(duì)高脂喂養(yǎng)雄性.ApoE-/-小鼠進(jìn)行免疫，產(chǎn)生了高滴度的FABP4特異性抗體。到首次免疫后第12w，疫苗組小鼠與對(duì)照組體重水平和日平均攝食量水平無(wú)明顯差異(P>0.05)，疫苗組空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR指數(shù)、腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)曲線下面積、TC、HDL、LDL和TC/HDL比

13、值均明顯低于佐劑組(P<0.05)，血清脂聯(lián)素水平高于佐劑組(P<0.05)，空腹TG、FFA、LDL/HDL比值與佐劑組無(wú)明顯差異(P>0.05)。主動(dòng)脈切片可見(jiàn)疫苗組動(dòng)脈斑塊占管腔面積百分比明顯低于佐劑組(P<0.05)。
　　 [結(jié)論]
　　 經(jīng)過(guò)HBc-FABP4、KLH-FABP4和FABP4三種蛋白疫苗的免疫，均可獲得高滴度的FABP4特異性抗體IgG，其中FABP4抗體滴度最高，顯示了良好的免疫效果。以FA