定心方對(duì)ApoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化及內(nèi)臟脂肪素表達(dá)的研究.pdf

1、一、背景
　　 自20世紀(jì)80年代以來(lái)，隨著我國(guó)人民物質(zhì)生活水平的提高，生活方式的改變，隨著中國(guó)人口正在逐步邁入老齡化進(jìn)程，加上肥胖人群及代謝綜合征發(fā)病率的增高，冠心病已成為我國(guó)最常見的心血管病病種，成為危害我國(guó)人民健康的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。冠心病的主要病理基礎(chǔ)是由血細(xì)胞、紊亂血流和血管壁之間的動(dòng)態(tài)相互作用結(jié)果形成的動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)，而AS的具體發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，研究者們先后提出脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說

2、、動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖學(xué)說、受體缺失學(xué)說、血栓源性學(xué)說、損傷反應(yīng)學(xué)說等假說，隨著對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到炎癥是AS發(fā)生發(fā)展過程中的重要因素。早在上世紀(jì)末Ross就提出AS是一種炎癥性疾病，越來(lái)越多的研究證實(shí)炎癥反應(yīng)在AS的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，并且貫穿于AS斑塊的形成、生長(zhǎng)到最后斑塊表面破裂并發(fā)血栓形成的所有階段。AS斑塊內(nèi)的炎癥反應(yīng)促使不穩(wěn)定斑塊的形成和破裂，并在此基礎(chǔ)上發(fā)生細(xì)胞成分的活化并介導(dǎo)血栓形成，是大多數(shù)

3、急性冠脈綜合征發(fā)生的中心啟動(dòng)環(huán)節(jié)。AS代表了慢性炎癥過程，系統(tǒng)性抑制炎癥過程可能是治療冠心病的關(guān)鍵。
　　 內(nèi)臟脂肪素(Visfatin)是一種近幾年新發(fā)現(xiàn)與炎癥和代謝綜合征有關(guān)的脂肪組織分泌的細(xì)胞因子， Visfatin與以往在淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種稱為“前B細(xì)胞集落增強(qiáng)因子”(pre-B cell colony-enhancing factor，PBEF)的免疫系統(tǒng)蛋白為同一物質(zhì)。Visfatin具有多種生物學(xué)活性，如模擬胰島

4、素樣活性、增加胰島素敏感性、參與炎癥反應(yīng)應(yīng)答、誘導(dǎo)血管生成、延緩中性粒細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)脂代謝等。雖然目前Visfatin在體內(nèi)的具體作用及作用機(jī)理尚未深入研究，但它的發(fā)現(xiàn)為研究糖尿病、代謝綜合征、心血管疾病等相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制、早期診斷及治療提供了新的思路。
　　 研究發(fā)現(xiàn)血漿Visfatin水平與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能在2型糖尿病患者中呈顯著負(fù)相關(guān)，而血管內(nèi)皮損傷是AS發(fā)生的起始環(huán)節(jié)之一。血漿Visfatin在代謝綜合征患者中顯著升高

5、，而在伴有頸動(dòng)脈粥樣硬化的患者其升高更為明顯。Visfatin在不伴有肥胖、糖尿病等代謝性疾病的冠心病患者中，水平同樣也升高。冠心病患者的血漿Visfatin水平顯著升高，特別是急性冠脈綜合癥患者升高更為明顯，Visfatin是獨(dú)立于既往已知冠心病危險(xiǎn)因素的又一新的危險(xiǎn)因素。通過病例對(duì)照研究得到了相同的結(jié)論，病例組的血漿Visfatin濃度顯著高于對(duì)照組，并且Visfatin與高敏C反應(yīng)蛋白(high sensitivity C-rea

6、ctive protein，hs-CRP)呈顯著正相關(guān)，多元回歸分析證實(shí)血漿Visfatin是心肌缺血性發(fā)作的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。有臨床研究顯示，冠心病患者血漿的Visfatin的升高伴有單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、hs-CRP等炎癥介質(zhì)的升高，進(jìn)行體外細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)得到類似的結(jié)論。此外，Visfatin可以增強(qiáng)單核細(xì)胞

7、株中單核細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)及外周血單核細(xì)胞中腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factor-alpha，TNF-α)、白介素-8(interleukin-8，IL-8)的表達(dá)。以上研究表明，Visfatin可能在AS炎癥反應(yīng)過程中扮演了重要角色。
　　 C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)是各種急性組織損傷、感染及其他各種炎

8、癥刺激的急性期反應(yīng)蛋白，不穩(wěn)定心絞痛患者可通過檢測(cè)血漿CRP濃度判斷愈后。通過檢測(cè)不穩(wěn)定型心絞痛病人血漿CRP，結(jié)果顯示CRP＞3μg/ml的患者存活率顯著低于CRP＜3μg/ml的患者。對(duì)于穩(wěn)定型心絞痛病人，經(jīng)行冠狀動(dòng)脈支架植入術(shù)72小時(shí)后測(cè)量血漿CRP水平，并開展持續(xù)1年的隨訪檢測(cè)，結(jié)果顯示CRP＜5μg/ml的患者存活率明顯高于CRP＞5μg/ml的患者。始于上世紀(jì)末的“醫(yī)師健康研究”是一項(xiàng)具有里程碑意義前瞻性研究成果，它主要通過

9、檢測(cè)健康個(gè)體中CRP濃度預(yù)測(cè)未來(lái)心血管疾病事件發(fā)生的危險(xiǎn)性。該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)1086名成年健康男性的基礎(chǔ)CRP水平，并開展持續(xù)8年的隨訪監(jiān)測(cè)，其中CRP水平較高543名男性后來(lái)發(fā)展為心肌梗塞、中風(fēng)及靜脈栓塞等心血管疾病，另543名男性沒有心血管疾病事件的報(bào)告。此后對(duì)絕經(jīng)期婦女進(jìn)行了前瞻性研究，同時(shí)比較了其它的炎癥標(biāo)志物，如血清淀粉樣P成分(serum amyloidPcomponent，SAP)、白介素-26(interleukin-2

10、6，IL-26)、細(xì)胞間黏附分子-21(intercellular adhesion molecule-21，sICAM21)等，發(fā)現(xiàn)CRP是最強(qiáng)有力的心血管病危險(xiǎn)的預(yù)示標(biāo)志物。近年來(lái)CRP已被作為一種冠心病的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)，美國(guó)心臟病協(xié)會(huì)達(dá)成以CRP作為測(cè)定心血管疾病危險(xiǎn)性指標(biāo)的共識(shí)。
　　 TNF-α是炎癥因子家族中較活躍，并較容易在外周循環(huán)中測(cè)得的細(xì)胞因子，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，主要參與炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)過程。TNF-α可以通過直

11、接介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞粘附、遷移，并積聚在受累內(nèi)皮下，形成內(nèi)皮功能障礙，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖，使內(nèi)皮正常平衡調(diào)節(jié)作用改變。TNF-α也能誘導(dǎo)血小板黏附，增強(qiáng)白細(xì)胞的趨化作用，促進(jìn)凝血、抑制纖溶、促進(jìn)單核細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附以及降低血管平滑肌細(xì)胞活性等作用，持續(xù)炎癥反應(yīng)過程，刺激平滑肌遷移和炎癥細(xì)胞交織，形成AS斑塊。同時(shí)TNF-α能抑制血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)間質(zhì)基因，是纖維帽變薄弱和平滑肌增生能力降低增加斑塊的易損性。在急性冠脈綜合癥患者的抗

12、炎治療中發(fā)現(xiàn)抗炎藥物都可以降低TNF-α的水平，血漿TNF-α水平與早期動(dòng)脈粥樣硬化的程度相關(guān)，提示TNF-α產(chǎn)生增加是動(dòng)脈粥樣硬化形成的一種早期而且重要的事件，人們認(rèn)為炎性細(xì)胞因子TNF-α可作為將來(lái)心血管事件發(fā)生的危險(xiǎn)因素和預(yù)測(cè)因子。
　　 中醫(yī)藥防治冠心病療效確切，中醫(yī)藥對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制具有多層次、多角度、多靶點(diǎn)的特征，其中抗炎是重要的機(jī)制之一。很多中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為，從中醫(yī)病因病機(jī)理論角度來(lái)看，AS具有“氣虛、血瘀、

13、痰濕”的特點(diǎn)，益氣活血祛痰應(yīng)是中醫(yī)藥防治AS主要方法之一。定心方是我校附屬南方醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科經(jīng)驗(yàn)方，由丹參、三七、赤芍、瓜蔞、茯苓、黨參、靈芝、酸棗仁、苦參、黃連等組成，具有益氣活血祛痰燥濕之功效，臨床研究證明其對(duì)冠心病有良好的療效。前期實(shí)驗(yàn)表明，定心方對(duì)缺血及再灌注損傷有良好的保護(hù)作用，其作用機(jī)制與降低核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）、TNF-α、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular a

14、dhesion molecule-1，ICAM-1)等炎癥介質(zhì)有關(guān)。
　　 二、目的
　　 本實(shí)驗(yàn)采用ApoE基因敲除小鼠加上高脂飼料喂養(yǎng)復(fù)制AS動(dòng)物模型，用定心方對(duì)ApoE基因敲除小鼠AS模型進(jìn)行干預(yù)，監(jiān)測(cè)在AS發(fā)展過程中Visfatin在血清和組織的蛋白表達(dá)，以了解Visfatin在AS中的作用。觀察定心方對(duì)AS斑塊的影響和對(duì)Visfatin及炎癥因子CRP、TNF-α表達(dá)的干預(yù)作用，為AS的預(yù)防和治療提供新的思路。

15、
　　 三、方法
　　 8周齡C57BL/6J背景的雄性ApoE-/-小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，隨機(jī)分為5組，每組7只。分別為模型組，辛伐他汀組，定心方低劑量組，定心方中劑量組，定心方高劑量組，并以7只8周齡雄性C57BL/6J小鼠作為空白對(duì)照組，所有小鼠均高脂飼料喂養(yǎng)。定心方低劑量組定心方藥液灌胃9.30g/kg，每日一次;定心方中劑量組定心方藥液灌胃18.59 g/kg，每日一次;定心方高劑量組定心方藥液灌胃37.18

16、g/kg，每日一次;辛伐他汀組辛伐他汀藥液灌胃5 mg/kg，每日一次，其他組給予等劑量生理鹽水灌胃。各組小鼠自由飲水，根據(jù)小鼠體質(zhì)量（每周測(cè)量1次），以校正給藥量，12周后停止藥物干預(yù)，結(jié)束實(shí)驗(yàn)。
　　 腹腔麻醉小鼠，眼球摘除法獲得血液標(biāo)本，行心臟灌注，自主動(dòng)脈根部至腹主動(dòng)脈末端分離整條主動(dòng)脈，一部分放入4％多聚甲醛中固定，一部分放入液氮中保存。
　　 主動(dòng)脈組織常規(guī)石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色觀察主動(dòng)脈組織病理學(xué)改變

17、，計(jì)算各組斑塊面積百分比。分離的血清，檢測(cè)總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三脂(triglycerides，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)和高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)含量。采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)血清中Visfatin、CRP、TNF-α的表達(dá)，觀察定心方對(duì)ApoE-/-小鼠AS模型中血清Visfatin、CRP

18、、TNF-α的影響。主動(dòng)脈組織提取蛋白，進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，觀察Visfatin表達(dá)的變化及定心方對(duì)其表達(dá)的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)屬于完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的計(jì)量資料，故采用單因素方差one-wayANOVA進(jìn)行方差分析，方差齊時(shí)采用LSD法進(jìn)行組間多重比較，方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3法進(jìn)行組間多重比較，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，變量間的相關(guān)的因素采用逐步多元直線回歸分析，P＜0.05為有顯著性差異。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)

19、的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 四、結(jié)果
　　 1.定心方對(duì)ApoE-/-小鼠體重及生長(zhǎng)情況的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)束后稱量體重，各組小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重均有一定的增加。空白對(duì)照組、模型組、辛伐他汀組、定心方低劑量組、定心方中劑量組、定心方高劑量組體重增加值分別為(3.83±0.93)g、(7.70±1.01)g、(6.87±0.82)g、(4.97±0.58)g、(4.87±0.70)g、(4.61±0.49)g，各間組小鼠體重增加值有顯著差

20、異（F=25.379，P=0.000）。各給藥組體重增加值均低于模型組，其中定心方低劑量組、定心方中劑量組、定心方高劑量組體重增加值與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;定心方高劑量組與定心方中劑量組、定心方低劑量組體重增加值無(wú)顯著差異（P＞0.05）;辛伐他汀組體重增加值與模型組相比無(wú)顯著性差異(P=0.054)。對(duì)各組小鼠的攝食情況觀察表明，各組小鼠攝食和飲水均正常。模型組小鼠毛色普遍缺乏光澤度，活動(dòng)較差，排泄尚正常。辛伐他汀組

21、、定心方低劑量組、定心方中劑量組、定心方高劑量小鼠的生長(zhǎng)情況較模型組有所改善。
　　 2.各組小鼠血脂各項(xiàng)指標(biāo)的變化對(duì)各組小鼠血清脂質(zhì)水平測(cè)定表明，模型組血脂水平顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），各給藥組血清TC、TG、HDL、LDL水平均低于模型組。與模型組相比，定心方高劑量組、辛伐他汀組血清TC、TG、HDL、LDL顯著降低(P＜0.05)，兩組組間比較比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。定心方高劑量組血脂水平低于定心方低、中

22、劑量組，其中TG水平顯著降低(P＜0.01)。
　　 3.定心方對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊病變病理觀察病理觀察可見空白對(duì)照組主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑完整，主動(dòng)脈壁厚薄均勻，內(nèi)膜、中膜及外膜結(jié)構(gòu)清晰，未見脂質(zhì)條紋或纖維斑塊。模型組主動(dòng)脈管壁厚薄不均，可見大量充滿脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞及膽固醇結(jié)晶裂隙的粥樣斑塊病灶，斑塊體積較大，其中脂質(zhì)核心較大，融合成片，內(nèi)膜廣泛而明顯的纖維化、增厚，血管壁向管腔內(nèi)突出，中膜平滑肌明顯萎縮變薄，外膜可見

23、結(jié)締組織增生及炎細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)，血管內(nèi)彈力膜圍繞面積明顯比空白對(duì)照組增大。各給藥組間小鼠主動(dòng)脈根部粥樣斑塊面積百分比有顯著差異（F=290.316，P=0.000）。與模型組比較，各給藥組小鼠主動(dòng)脈根部AS病變得以不同程度的控制，其中定心方低劑量組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊內(nèi)的脂質(zhì)中心面積相對(duì)變小，纖維帽較厚;辛伐他汀、定心方中劑量組、定心方高劑量組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊面積百分比明顯減小。模型組與辛伐他汀組、定心方中劑量組、定心方高劑量組小鼠主

24、動(dòng)脈根部粥樣斑塊面積百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;定心方低劑量組與模型組主動(dòng)脈根部動(dòng)脈粥樣斑塊面積百分比之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.849);定心方高劑量組與定心方中劑量組主動(dòng)脈根部動(dòng)脈粥樣斑塊面積百分比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）;定心方高劑量組與辛伐他汀組主動(dòng)脈根部動(dòng)脈粥樣斑塊面積百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)。定心方各給藥組從對(duì)AS病變的抑制效果呈量效關(guān)系。
　　 4.定心方對(duì)ApoE-/-小

25、鼠血清CRP水平的影響各組間小鼠血清CRP水平有顯著差異（F=238.171，P=0.000）。與空白對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠血清CRP水平明顯增高(P=0.000)。辛伐他汀組、定心方低劑量組、定心方中劑量組、定心方高劑量組小鼠血清CRP水平顯著低于模型組小鼠(P＜0.01)。定心方高劑量組CRP水平低于定心方低劑量組、定心方中劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;定心方高劑量組小鼠血清CRP水平低于辛伐他汀組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理兩

26、組間差異無(wú)顯著性(P=0.635)。
　　 5.定心方對(duì)ApoE-/-小鼠血清TNF-α水平的影響各組間小鼠血清TNF-α水平有顯著差異（F=288.101，P=0.000）。與空白對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠血清TNF-α水平明顯增高(=0.000)。辛伐他汀組、定心方低劑量組、定心方中劑量組、定心方高劑量組小鼠血清TNF-α水平顯著低于模型組小鼠(P＜0.01)。定心方高劑量組TNF-α水平低于定心方低劑量組、定心方中劑量組，

27、差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;定心方高劑量組小鼠血清TNF-α水平高于辛伐他汀組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理兩組間差異無(wú)顯著性(P=0.998)。
　　 6.Western blot檢測(cè)各組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織中Visfatin蛋白表達(dá)通過分析結(jié)果中目的條帶圖像發(fā)現(xiàn)，各組間主動(dòng)脈組織中Visfatin蛋白的表達(dá)有顯著性差異（F=201.400，P=0.000）。與空白組相比，模型組主動(dòng)脈組織Visfatin的表達(dá)較空白對(duì)照組顯著

28、升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.000）;辛伐他汀組、定心方中劑量組、定心方高劑量組主動(dòng)脈組織Visfatin水平與模型組相比有所降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;定心方高劑量組Visfatin水平低于定心方低劑量組、定心方中劑量組（P＜0.05）），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;辛伐他汀組與定心方高劑量組主動(dòng)脈組織Visfatin的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.869）。
　　 7.定心方對(duì)ApoE-/-小鼠血清Visfatin

29、水平的影響檢測(cè)ApoE-/-小鼠血清中Visfatin水平，各組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=373.845，P=0.000）。模型組小鼠血清Visfatin含量較空白對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);辛伐他汀組、定心方中劑量組、定心方高劑量組小鼠血清Visfatin含量低于模型組(P＜0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;定心方高劑量組血清Visfatin水平低于定心方低劑量組、定心方中劑量組（P＜0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

30、;定心方高劑量組與辛伐他汀組小鼠血清Visfatin含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.793）。
　　 8.ApoE-/-小鼠血清和組織Visfatin表達(dá)與血清CRP、TNF-α水平的相關(guān)性分析逐步多元直線回歸分析顯示ApoE-/-小鼠血清Visfatin水平與血清CRP水平呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)關(guān)系具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（R2=0.893，F(xiàn)=334.545，p=0.000）;血清Visfatin水平與血清TNF-α水平的相關(guān)關(guān)系不具有統(tǒng)計(jì)

31、學(xué)意義（P=0.174）。ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織Visfatin表達(dá)與血清TNF-α水平呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)關(guān)系具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（R2=0.856，F(xiàn)=95.352，P=0.000）;主動(dòng)脈組織Visfatin表達(dá)與血清與血清CRP水平的相關(guān)關(guān)系不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.181）。
　　 五、結(jié)論
　　 1.不同劑量定心方均可減輕ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈病理病變，定心方高劑量組管腔狹窄程度明顯減輕，斑塊較小，優(yōu)于辛伐他

32、汀組。
　　 2.不同劑量定心方均可明顯減輕AS病程中ApoE-/-小鼠體重增加值，定心方給藥組ApoE-/-小鼠血脂水平顯著下降，說明定心方對(duì)ApoE基因缺陷小鼠有降脂和減肥作用，延緩了AS進(jìn)展。
　　 3.模型組小鼠血清CRP、TNF-α水平、血脂水平較空白對(duì)照組小鼠明顯增高，而高劑量定心方治療后血清CRP、TNF-α水平及血脂水平顯著下降，并顯示出比對(duì)照藥辛伐他汀更為突出的效果，證實(shí)了定心方對(duì)AS的抑制作用，定心方

33、可能通過減輕ApoE-/-小鼠炎癥反應(yīng)而起到抗AS及穩(wěn)定斑塊的作用。
　　 4.Visfatin在模型組小鼠血清和組織中高表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了Visfatin與AS之間存在明確的相關(guān)性，其可能參與了AS的發(fā)生發(fā)展。ApoE-/-小鼠的血清中的Visfatin與血清CRP存在顯著正相關(guān)關(guān)系，主動(dòng)脈組織中的Visfatin與血清TNF-α水平存在顯著正相關(guān)關(guān)系，提示Visfatin參與炎癥應(yīng)答。
　　 5.中、高劑量定心方治療