內(nèi)臟脂肪素在動脈粥樣硬化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分： 目的：通過測定不同動脈粥樣硬化程度受試者的血漿visfatin水平與內(nèi)皮功能狀態(tài)，探討在動脈粥樣硬化患者中血漿visfatin水平與血管內(nèi)皮功能紊亂之間關(guān)系，評估血漿visfatin水平在預(yù)測動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的意義。 方法：同時接受冠脈造影和超聲檢測頸總動脈、肱動脈的215例患者納入本研究，包括55名接受PCI術(shù)的急性冠狀動脈綜合征（ACS）患者。采用冠脈造影及頸總動脈超聲和頸總動脈IMT結(jié)果評估冠狀動

2、脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度，采用Gensini積分系統(tǒng)，將入選患者分為正常對照組、輕度動脈粥樣硬化組、中度動脈粥樣硬化組、重度動脈粥樣硬化組。所有組患者檢測血漿visfatin和血清ADMA水平并同時超聲檢測肱動脈FMD評估血管內(nèi)皮功能。 結(jié)果：（1）與正常對照組比較，動脈粥樣硬化組血漿visfatin水平顯著升高，且嚴(yán)重動脈粥樣硬化組高于早期和中度動脈粥樣硬化組。（2）采用線性回歸統(tǒng)計(jì)學(xué)方法證實(shí)，血漿visfatin水平與頸總動脈I

3、MT呈正相關(guān)（r=0.158；P<0.05）；血漿visfatin水平與冠脈Gensini積分的正相關(guān)（r=0.306；P<0.01）；血漿visfatin水平與ADMA水平呈顯著正相關(guān)（r=0.323；P<0.01），而與肱動脈FMD呈負(fù)相關(guān)（r=-0.243；P<0.01）。（3）急性冠狀動脈綜合征（ACS）患者接受PCI術(shù)后，血漿visfatin水平和血清AMDA水平顯著降低（P<0.01）。 結(jié)論：動脈粥樣硬化患者血漿v

4、isfatin水平升高，并能反映血管內(nèi)皮功能紊亂情況和動脈粥樣硬化嚴(yán)重程度，提示血漿visfatin水平可能與動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，是一個新的心血管疾病預(yù)測因子。 第二部分： 目的：內(nèi)臟脂肪素（visfatin）是一種能夠促進(jìn)血管新生的新型脂肪細(xì)胞因子。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）作為血管新生中非常關(guān)鍵的因子，在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞，二甲基精氨酸-二甲胺水解酶2（DDAH2）能夠上調(diào)VEGF的表達(dá)促進(jìn)血管新生。本實(shí)

5、驗(yàn)研究DDAH2在visfatin誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞血管新生中的作用。 方法：在培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），不同濃度的重組visfatin（0.01nM-3nM）處理6-24h。Tube形成實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)評價(jià)內(nèi)皮細(xì)胞血管新生能力；RealtimePCR檢測DDAH2和VEGFmRNA水平；HLPC（高效液相色普儀）測定細(xì)胞內(nèi)ADMA水平；Griess法測定細(xì)胞內(nèi)NO水平；ELISA試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)VEGF水平；Western

6、blot測定Akt的磷酸化和DDAH2蛋白水平；hDDAH2siRNA沉默內(nèi)皮細(xì)胞DDAH2的表達(dá)。 結(jié)果：重組visfatin能呈濃度和時間依賴性增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞血管形成和遷移能力；同時，visfatin能夠上調(diào)DDAH2和VEGF的mRNA和蛋白水平。在DDAH2沉默的內(nèi)皮細(xì)胞，visfatin促內(nèi)皮細(xì)胞新生的作用也顯著降低。Westernblot結(jié)果顯示，visfatin作用內(nèi)皮細(xì)胞能誘導(dǎo)Akt磷酸化。預(yù)先使用PI3K的特異性

7、抑制劑能抑制visfatin誘導(dǎo)的DDAH2和VEGF的表達(dá)上調(diào)。 結(jié)論：我們的實(shí)驗(yàn)證明，visfatin能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管新生，其機(jī)制與激活PI3K/Akt，上調(diào)DDAH-VEGF通路有關(guān)。 第三部分： 目的：內(nèi)臟脂肪素（Visfatin）是一種新的脂肪細(xì)胞因子。最近研究發(fā)現(xiàn)，visfatin通過調(diào)節(jié)SIRT1水平抗內(nèi)皮細(xì)胞衰老。冠心病患者內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）的衰老損傷其增殖、遷移能力和脈管的形成，同時導(dǎo)致

8、循環(huán)中EPC數(shù)量的降低，提示EPCs衰老在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)研究visfatin對EPCs衰老的影響。 方法：密度梯度離心法分離人臍血和外周血的單個核細(xì)胞，利用EGM-2細(xì)胞培養(yǎng)基（含EPCs分化所需各種生長因子）進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)單個核細(xì)胞貼壁向EPCs分化。流式細(xì)胞術(shù)測定早期EPCs干細(xì)胞分子標(biāo)志CD34+、vWF；Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1雙染鑒定正在分化的EPCs。不同濃度的

9、重組visfatin（0.01nM-10nM）處理24h。Tube形成實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)評價(jià)EPCs血管新生能力；RealtimePCR檢測SIRT1mRNA水平；Westernblot測定SIRT1蛋白水平；端粒酶定量法檢測端粒酶活性；β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測細(xì)胞β-半乳糖苷酶活性；使用熒光染料H2DCF檢測細(xì)胞內(nèi)氧自由基（ROS）的生成。 結(jié)果：（1）0.1nM和1nM的visfatin能增加EPCs形成管腔樣結(jié)構(gòu)和促進(jìn)EP

10、Cs遷移，10nM的visfatin組EPCs形成管腔樣結(jié)構(gòu)能力和遷移能力卻顯著降低（與1nMvisfatin組比）。（2）0.1nM和1nMvisfatin組細(xì)胞端粒酶活性和SIRT1水平明顯升高（和對照組比），而3nM和10nMvisfatin組細(xì)胞端粒酶活性和SIRT1水平明顯降低（與1nMvisfatin組比）。（3）0.1nMvisfatin組細(xì)胞β-半乳糖苷酶活性明顯降低（和對照組比），而3nM和10nMvisfatin組細(xì)

11、胞β-半乳糖苷酶活性明顯升高（與0.1nMvisfatin組比）。（4）visfatin能濃度依賴地增加EPCs內(nèi)ROS的水平，而預(yù)先使用DPI300μM和Allopurinol100μM能顯著抑制10nMvisfatinrn所致EPCs端粒酶活性、SIRT1mRNA表達(dá)的降低和β-半乳糖苷酶活性的升高（P<0.01）。 結(jié)論：生理濃度visfatin能抑制EPCs的衰老，病理濃度抑制其衰老作用降低，其機(jī)制可能與激活ROS的水平