多功能超聲造影劑顯像及治療腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分、多功能超聲造影劑的制備及性能檢測(cè)
　　目的：分別制備兩種多功能超聲造影劑:載染料蘇丹黑B的聚乳酸羥基乙酸超聲微泡造影劑(SB-PLGA)和載阿霉素的超順磁性聚乳酸羥基乙酸超聲微泡造影劑(DOX-SPLGA)，并檢測(cè)其一般特性。
　　方法：采用雙乳化法和真空冷凍干燥法分別制備出SB-PLGA及不同鐵濃度的DOX-SPLGA，并對(duì)其進(jìn)行粒徑，形態(tài)，包封率等性質(zhì)檢測(cè);其中對(duì)載藥微泡DOX-SPLGA還進(jìn)行了體外釋藥實(shí)驗(yàn)觀

2、察，采用原子吸收分光光度計(jì)檢測(cè)造影劑的鐵含量;用振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)及磁共振儀檢測(cè)造影劑的磁學(xué)性質(zhì);體外超聲和磁共振顯像評(píng)價(jià)造影劑的顯像效果。
　　結(jié)果：SB-PLGA外觀呈蓬松的藍(lán)色粉末狀，溶于水后為均勻的深藍(lán)色乳液，分散度好。掃描電鏡觀察微泡粒徑1～2μm，其形態(tài)規(guī)則，呈球形，表面光滑，大小均勻。馬爾文電位檢測(cè)其Zeta電位為(20.80±1.60) mV，SB的包封率為(85.67±1.44)％，載藥量為(3.43±0.06)％，

3、分散度好。DOX-SPLGA外觀呈黃褐色粉末，溶于水后為均勻的乳液，分散度較好。掃描電鏡觀察微泡呈球形，表面有孔，大小較均勻，透射電鏡顯示微泡為殼核結(jié)構(gòu)，SPIO納米顆粒分布于微泡的殼膜中。原子吸收光譜法得到7種不同鐵濃度制得的DOX-SPLGA中的鐵含量分別為(1.47±0.07)μg/ml,(2.83±0.08)μg/ml,(5.76±0.33)μg/ml,(14.77±0.32)μg/ml,(28.06±0.62)μg/ml,(5

4、6.71±0.44)μg/ml,(185.45±1.06)μg/ml，其相對(duì)應(yīng)的DOX的包封率分別為(58.10±1.61)％，(57.73±3.45)％,(60.30±2.67)％,(57.53±0.80)％,(61.13±0.95)％,(56.07±1.55)％，(59.60±1.61)％;DOX的載藥量分別為(5.81±0.16)％，(5.77±0.35)％,(6.03±0.27)％,(5.75±0.08)％,(6.11±0.10

5、)％,(5.61±0.16)％,(5.96±0.16)％。造影劑的粒徑為800～900nm，具有超順磁性，其磁敏感效應(yīng)與殼膜中裝載的SPIO的含量有關(guān)。體外超聲顯像實(shí)驗(yàn)顯示，DOX-SPLGA能夠較普通PLGA造影劑產(chǎn)生更強(qiáng)的超聲回聲。體外磁共振顯像實(shí)驗(yàn)顯示，T2*信號(hào)隨著造影劑內(nèi)鐵濃度的增高而降低。
　　結(jié)論：SB-PLGA造影劑為藍(lán)色粉末，粒徑均勻，分散好，為其之后既能外科手術(shù)前進(jìn)行腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)超聲顯像，又能手術(shù)活檢時(shí)指示

6、定位淋巴結(jié)提供了基礎(chǔ)。DOX-SPLGA造影劑具有形態(tài)規(guī)則，大小較均一，表面光滑有孔，分散均勻，超順磁性等優(yōu)點(diǎn)，在體外能夠增強(qiáng)超聲、磁共振顯像，同時(shí)能載藥輔助化療，是一種有應(yīng)用前景的多功能超聲造影劑。
　　第二部分、載染料蘇丹黑B的多功能超聲造影劑增強(qiáng)超聲顯像實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：探討SB-PLGA造影劑的細(xì)胞毒性及被巨噬細(xì)胞吞噬的能力;探討SB-PLGA造影劑對(duì)兔腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的超聲顯像和手術(shù)示蹤效果，及其在淋巴結(jié)組織內(nèi)的分

7、布情況。
　　方法：體外培養(yǎng)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7，加入同一濃度SB-PLGA造影劑孵育3h、24h和48h后，光鏡下觀察巨噬細(xì)胞對(duì)造影劑的吞噬情況，用MTT法檢測(cè)造影劑對(duì)巨噬細(xì)胞增殖活性的影響。采用瘤塊組織懸液種植法建立兔VX2胭窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)模型，建模后14天用于腫瘤淋巴結(jié)超聲顯像。選取腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)模型兔8只，共16個(gè)腫瘤淋巴結(jié)（實(shí)驗(yàn)組8個(gè)，對(duì)照組8個(gè)），實(shí)驗(yàn)組給予SB-PLGA造影劑，對(duì)照組給予等量生理鹽水，分

8、別經(jīng)足墊皮下間隙注射，行超聲造影檢查評(píng)價(jià)胭窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及第二站腹股溝淋巴結(jié)的增強(qiáng)效果;并分別于30min后行胭窩和腹股溝淋巴結(jié)清掃術(shù)，切除藍(lán)染及未染色淋巴結(jié)，進(jìn)行冰凍切片HE染色。
　　結(jié)果：光鏡下觀察，巨噬細(xì)胞對(duì)SB-PLGA造影劑的吞噬量隨著造影劑與細(xì)胞孵育時(shí)間的增加而增加。MTT結(jié)果顯示，SB-PLGA造影劑被巨噬細(xì)胞吞噬后對(duì)其增殖活性無(wú)明顯影響。超聲造影可明顯增強(qiáng)兔胭窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)顯像，而同側(cè)腹股溝淋巴結(jié)及注射生理鹽

9、水組顯像不明顯。胭窩淋巴結(jié)清掃術(shù)中可見(jiàn)，注射SB-PLGA造影劑組淋巴結(jié)染色效果好;而腹股溝淋巴結(jié)清掃術(shù)中均未見(jiàn)第二站淋巴結(jié)藍(lán)染。淋巴結(jié)冰凍切片HE染色可見(jiàn)，SB-PLGA存在于淋巴竇內(nèi)，并有大量進(jìn)入巨噬細(xì)胞。
　　結(jié)論：SB-PLGA在體外能夠被巨噬細(xì)胞吞噬，且對(duì)細(xì)胞增殖活性無(wú)明顯影響。SB-PLGA能夠被淋巴結(jié)內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬，增強(qiáng)淋巴結(jié)超聲顯像，同時(shí)又能通過(guò)染色來(lái)指示定位淋巴結(jié)，是一種良好的多功能超聲造影劑。
　　第三部

10、分、載阿霉素的超順磁性多功能超聲造影劑顯像和治療腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：探討DOX-SPLGA造影劑對(duì)兔腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的超聲和磁共振顯像效果;探討DOX-SPLGA造影劑聯(lián)合低頻超聲促進(jìn)藥物釋放對(duì)兔腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的治療效果。
　　方法：新西蘭大白兔42只，采用瘤塊種植法于大腿外側(cè)植入VX2腫瘤組織塊懸液，建立兔胭窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)模型。建模后第15天，取12只模型兔（24個(gè)腫瘤淋巴結(jié)），隨機(jī)分為三組（每組8個(gè)腫瘤淋

11、巴結(jié)），分別為DOX-SPLGA組（經(jīng)足墊皮下注射DOX-SPLGA微泡）、PLGA組（經(jīng)足墊皮下注射普通PLGA微泡）及對(duì)照組（經(jīng)足墊皮下注射等量生理鹽水），行超聲和磁共振掃描，并應(yīng)用圖像分析軟件評(píng)價(jià)造影效果。掃描結(jié)束后，取淋巴結(jié)組織進(jìn)行HE染色和普魯士藍(lán)染色，以及透射電鏡檢查。建模后第15天，取30只模型兔（60個(gè)腫瘤淋巴結(jié)），隨機(jī)分為6組（每組10個(gè)腫瘤淋巴結(jié)），包括空白對(duì)照組(C)、載藥微泡(DOX-SPLGA)、單純藥物組(D

12、OX)、單純微泡+超聲組(PLGA+US)、藥物+超聲組(DOX+US)、載藥微泡+超聲組(DOX-SPLGA+US)。治療后取腫瘤淋巴結(jié)組織，用免疫組化法檢測(cè)淋巴結(jié)組織PCNA、CD34及LYVE-1的表達(dá);TUNEL法檢測(cè)淋巴結(jié)內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：在超聲顯像的造影模式和傳統(tǒng)灰階模式下，與對(duì)照組相比，經(jīng)DOX-SPLGA與普通PLGA微泡造影后，胭窩淋巴結(jié)均可見(jiàn)回聲增強(qiáng);且DOX-SPLGA組比普通PLGA組回聲更強(qiáng)。在

13、磁共振顯像中，DOX-SPLGA組表現(xiàn)出明顯負(fù)性增強(qiáng)效果，普通PLGA組負(fù)性增強(qiáng)效果較弱，而對(duì)照組未見(jiàn)明顯增強(qiáng)。普魯士藍(lán)染色和透射電鏡結(jié)果均證實(shí)了DOX-SPLGA存在于淋巴結(jié)組織內(nèi)。免疫組化結(jié)果顯示，DOX-SPLGA+US組的凋亡指數(shù)(AI)顯著高于其它各組(P＜0.05);DOX-SPLGA+US組的腫瘤增殖受到明顯抑制，其增殖指數(shù)明顯低于其它各組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：DOX-SPLGA造影劑能顯著增強(qiáng)顯像超聲和磁共