中華絨螯蟹對細(xì)菌的清除作用及部分免疫因子的初步研究.pdf

1、隨著中華絨螯蟹養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，病害同益嚴(yán)重并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，成為生產(chǎn)發(fā)展的主要制約因素，及時有效地防治疾病危害已成為滿足中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展的迫切要求。研究中華絨螯蟹的免疫功能，提高其自身免疫力，是解決其病害防治問題的重要途徑之一。本論文對中華絨螫蟹血淋巴的抗菌活性，血淋巴酚氧化酶的部分生化特性，血清的凝集活性，血細(xì)胞的體外吞噬能力以及對細(xì)菌的清除作用等基礎(chǔ)免疫功能進(jìn)行了初步研究，探討了中華絨螫蟹對細(xì)菌的清除作用，部分免疫因

2、子的性質(zhì)及其在細(xì)菌清除中的作用，以期能夠為中華絨螯蟹細(xì)菌性疾病免疫防治工作的開展提供理論參考。 產(chǎn)生抗菌物質(zhì)對于甲殼動物清除侵入體內(nèi)細(xì)菌，維持機(jī)體健康具有重要作用，因此探討了中華絨螯蟹血清和血細(xì)胞溶解上清液(HLS)對大腸桿菌Escherichiacoli、嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila、蠟狀芽胞桿菌Bacillus cereus和金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus4種細(xì)菌的抗菌活性、

3、不同濃度血細(xì)胞溶解上清液(Hemocyte Lysate Supernatant，HLS)對抗菌活性的影響以及血清中抗菌活性的誘導(dǎo)。結(jié)果顯示，只有HLS對大腸桿菌、嗜水氣單胞菌表現(xiàn)出顯著的抗菌活性，而血清對4種菌和HLS對蠟狀芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌均未表現(xiàn)出抗菌活性；隨著HLS濃度的降低，大腸桿菌的細(xì)菌存活指數(shù)(SI)迅速上升，抗菌活性迅速下降，HLS濃度高低直接影響抗菌活性的強(qiáng)弱；通過注射滅活大腸桿菌，血清在1h-24h內(nèi)表現(xiàn)出抗菌

4、活性的誘導(dǎo)作用，6h時抗菌活性最強(qiáng)。 酚氧化酶原系統(tǒng)對甲殼動物的免疫識別及免疫調(diào)理功能具有重要作用，故對中華絨螯蟹血淋巴的血清、血漿和血細(xì)胞溶解上清液(HLS)中酚氧化酶(PO)的活力以及該酶最適pH和溫度進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明在血清和HLS中都有PO活力，而血漿中無PO的存在，血清中的PO來自于血細(xì)胞；以L-Dopa為底物，中華絨螫蟹.PO活力的最適pH值為6.5，最適溫度為40℃。采用SDS、Ca<'2+>、Mg<'2+>

5、以及SDS與Ca<'2+>聯(lián)合和SDS與Mg<'2+>聯(lián)合分別對酚氧化酶原(proPO)進(jìn)行激活實驗，血清和HLS中的PO活力都有顯著的增加，其中SDS的激活作用最強(qiáng)，Ca<'2+>、Mg<'2+>的激活作用最弱，SDS與Ca<'2+>聯(lián)合和SDS與.Mg<'2+>聯(lián)合的混合激活作用介于SDS和Ca<'2+>、Mg<'2+>之間，激活實驗表明中華絨螫蟹的PO主要以酚氧化酶原(proPO)形式存在于血細(xì)胞中。 甲殼動物凝集素具有多

6、種生理生化功能，如能夠凝集細(xì)菌、細(xì)胞；增強(qiáng)細(xì)胞吞噬活性等。以醛化紅細(xì)胞為實驗材料，確定了中華絨螯蟹血清中含有能夠凝集醛化雞紅細(xì)胞和醛化鼠紅細(xì)胞的凝集素，其凝集效價分別為2<'4>和2<'7>，但中華絨螫蟹血清對大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、蠟狀芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌無凝集活性。利用血清能夠凝集醛化雞紅細(xì)胞的特點，對凝集素進(jìn)行了初步分離，經(jīng)SDS-PAGE電泳測得其分子量為77kDa。 吞噬作用是甲殼動物保護(hù)自身免受微生物侵害的重要免

7、疫功能，測定其體外吞噬能力對于評價免疫系統(tǒng)的狀態(tài)具有重要意義。采用體外血細(xì)胞培養(yǎng)的方法，研究了中華絨螯蟹血細(xì)胞對蠟狀芽孢桿菌和醛化鼠紅細(xì)胞的吞噬能力。結(jié)果表明：在體外，貼壁培養(yǎng)的中華絨螯蟹血細(xì)胞1hr的存活率可達(dá)92.5±0.9％。少量的細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞內(nèi)含有大量具有明顯的折光性的顆粒，細(xì)胞貼壁性能差；絕大部分貼壁的細(xì)胞，呈扁平狀，其胞質(zhì)內(nèi)含有一個明顯的細(xì)胞核和一些小的顆粒，緊密地貼附于玻片上并伸出類似于偽足的原生質(zhì)突起，伸展后

8、血細(xì)胞的長度可達(dá)數(shù)十微米，具有吞噬功能，其對蠟狀芽胞桿菌吞噬率為5.1±1.4％，不能吞噬小鼠紅細(xì)胞，血清孵育不能增強(qiáng)中華絨鰲蟹血細(xì)胞體外吞噬能力。 在對中華絨螯蟹幾種免疫因子體外研究的基礎(chǔ)上，探討了中華絨螯蟹對侵入體內(nèi)細(xì)菌的清除作用。首先采用顏料法確定了中華絨螯蟹循環(huán)血體積(V)與體重(T)問的回歸曲線方程V=0.1576T-0.898(Rs=0.83，P<0.01)，循環(huán)血體積與體重的百分比(V/T)為14.86±2.95％

9、。在確定中華絨螯蟹循環(huán)血體積的基礎(chǔ)上，通過注射革蘭氏陽性蠟狀芽孢桿菌和革蘭氏陰性大腸桿菌，探討進(jìn)入中華絨螯蟹體內(nèi)細(xì)菌隨時間變化的清除規(guī)律以及通過組織學(xué)觀察探討細(xì)菌的清除方式。結(jié)果表明：中華絨螯蟹對兩種細(xì)菌的清除作用相似，在注射菌后60min時對蠟狀芽孢桿菌和大腸桿菌的細(xì)菌清除率都達(dá)到最高，分別為88.57±4.84％和90.15±3.88％，120min時對兩種細(xì)菌清除率與60min時相比無顯著性差異(P>0.05)；中華絨螯蟹的鰓和心