中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)凝血因子的cDNA克隆及表達(dá)模式研究.pdf

1、目的：凝血因子是一種在機(jī)體抗凝、促凝的凝血酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中有重要作用的生物活性蛋白，其功能主要是催化纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白和作為信號(hào)因子激發(fā)免疫系統(tǒng)，研究顯示人凝血因子制劑是治療血友病A的有效藥物，鱟血淋巴制備的鱟試劑（Limulus amoebocyte lysate,LAL）對(duì)于極微量的病毒和污染物有較強(qiáng)敏感度，蛇凝血因子在炎癥和治療血栓病上有重要作用。河蟹（Eriocheir sinensis）為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)蟹類，近年來由于養(yǎng)殖規(guī)

2、模的擴(kuò)大及水質(zhì)的退化，病害造成的損失越發(fā)嚴(yán)重，為應(yīng)對(duì)病害除了使用抗生素等藥物外，對(duì)于河蟹自身免疫的研究也越來越受到重視。如何最大程度地激發(fā)其免疫潛能，獲得抗病力強(qiáng)的個(gè)體，是水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種領(lǐng)域值得探究的主要課題。本研究通過克隆河蟹凝血因子基因cDNA序列，分析其基因結(jié)構(gòu)，原核表達(dá)獲得重組蛋白并制備多克隆抗體，運(yùn)用Real-time RT-PCR、Western blot技術(shù)探究凝血因子在河蟹生理及病理?xiàng)l件下mRNA和蛋白的表達(dá)特征，揭示

3、該基因在河蟹血凝及免疫過程中可能發(fā)揮的作用，以期為河蟹的抗病育種提供重要的理論基礎(chǔ)。
　　方法：運(yùn)用 RACE技術(shù)從河蟹肝臟中克隆凝血因子全長(zhǎng) cDNA，通過pET32a(+)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)凝血因子融合蛋白，并經(jīng)鎳柱純化融合蛋白。通過Real-time RT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)：（1）健康河蟹各組織的凝血因子mRNA相對(duì)表達(dá)水平；（2）嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）感染河蟹后0 h，1.5 h，3 h，6 h，12 h

4、，24 h和48 h在心臟、肝胰臟和血淋巴中凝血因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化情況；（3）河蟹螯足折斷后0.5 h，1 h，1.5 h，3 h和6 h在心臟、肝胰臟和血淋巴中凝血因子mRNA的相對(duì)表達(dá)量變化情況。并以鎳柱純化的河蟹凝血因子融合蛋白為抗原免疫家兔，制備河蟹凝血因子多克隆抗體，經(jīng)瓊脂雙擴(kuò)散法和間接酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)抗體效價(jià)后，用Western bolt驗(yàn)證抗體的特異性，同時(shí)檢測(cè)嗜水氣單胞菌感染和斷肢后河蟹心臟、肝胰臟和血淋巴中

5、天然凝血因子蛋白的分泌特征。
　　結(jié)果：河蟹凝血因子cDNA全長(zhǎng)2279bp，包含一個(gè)936bp的開放閱讀框，編碼長(zhǎng)度為311個(gè)氨基酸的多肽，預(yù)測(cè)分子量為33.75kDa，理論等電點(diǎn)為9.38。同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，河蟹凝血因子蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)與大多數(shù)物種凝血酶原相似，并與內(nèi)達(dá)華古白蟻（Zootermopsis nevadensis）凝血因子親緣關(guān)系最近。對(duì)凝血因子在河蟹不同組織中mRNA相對(duì)表達(dá)水平的研究表明，凝血因子在心

6、臟、肝胰臟和血淋巴中較其他組織表達(dá)量較高。嗜水氣單胞菌感染后，河蟹肝胰臟和血淋巴中凝血因子mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，并在3 h時(shí)達(dá)到高峰，心臟組織則在感染后24 h時(shí)達(dá)到高峰。人為折斷河蟹螯足后，在心臟、肝胰臟和血淋巴中凝血因子mRNA相對(duì)表達(dá)量分別在0.5 h、1 h和1.5 h達(dá)到高峰。Western bolt結(jié)果顯示，所制備的多克隆抗體可特異性識(shí)別河蟹凝血因子重組蛋白；對(duì)河蟹體內(nèi)凝血因子蛋白的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：未處理的健康河蟹心臟、肝胰

7、臟和血淋巴組織內(nèi)凝血因子蛋白含量極少，而經(jīng)嗜水氣單胞菌感染和斷肢后，對(duì)應(yīng)組織中則大量表達(dá)該凝血因子蛋白。
　　結(jié)論：我們克隆并鑒定了河蟹凝血因子，證明在無脊椎動(dòng)物中也同樣存在凝血因子。凝血因子基因主要在河蟹心臟、肝臟和血淋巴組織中大量表達(dá)。在嗜水氣單胞菌感染和斷肢后，河蟹心臟、肝胰臟和血淋巴組織中凝血因子mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增加。Western blot結(jié)果顯示，健康河蟹機(jī)體內(nèi)凝血因子蛋白含量極低，在受到嗜水氣單胞菌感染和斷肢刺