納米珍珠層人工骨的制備及實驗研究.pdf

1、珍珠層（nacre or mother of pearl）是軟體動物珍珠貝科或蚌科動物的貝殼內(nèi)層部分，其主要成分為文石型碳酸鈣，并含有少量有機質(zhì)和微量金屬元素。1992年法國科學家Lopez首先在研究中發(fā)現(xiàn)珍珠層具有誘導成骨的作用。此后，大量研究均證實這種天然生物材料具有良好的生物相容性，并且具有骨誘導和骨傳導作用。學者們認為珍珠層的骨誘導作用來自于其中的有機質(zhì)成分，其中全部或部分成分可能是具有骨誘導作用的信號分子。于是，國內(nèi)外學者開展

2、了廣泛的、將珍珠層單一材料或以其為原材料制備的復合人工骨植入骨缺損部位的實驗研究，這些包括將珍珠層塊體植入骨承重部位和將珍珠層顆粒及粉末填充骨缺損的實驗，以及將珍珠層復合人工骨植入大段骨缺損的實驗，這些實驗研究均顯示出來源于這種天然材料良好的成骨效果。 理想的骨組織植入修復材料應具有良好的生物相容性，具有足夠的強度，能有效充當新骨形成的支架，具骨誘導和骨傳導作用進而能有效促進骨形成，并能在體內(nèi)逐漸發(fā)生生物降解，被骨組織替代，以達

3、到完全修復的目的。隨著對珍珠層材料研究的深入，學者們發(fā)現(xiàn)這種材料雖然具有良好的生物學活性，其降解卻是一個相當長期的過程。經(jīng)研究分析，這主要與珍珠層材料的理化成分及形態(tài)大小兩種因素有關。一方面，碳酸鈣鹽在植入?yún)^(qū)域形成了弱堿性的環(huán)境，不利于材料的降解吸收；另一方面，當珍珠層的形態(tài)逐漸變小，由塊狀、顆粒狀再到粉末狀，其降解吸收則呈現(xiàn)上升的趨勢。通過各種研究，人們發(fā)現(xiàn)，珍珠層這種天然材料的生物降解主要是建立在非特異性的理化溶解方式上，而活性細胞

4、介導的吸收方式對于這種材料的降解作用有限。 如何改善這種材料的降解性能，使之能夠更好地發(fā)揮骨修復作用，并被宿主新生骨順利的長入替代，是當前在這方面研究所面臨的最主要問題。引起我們注意的是，目前國內(nèi)外進行廣泛的實驗研究所采用的珍珠層粉，均是屬于微米級的粉體，由此可知其內(nèi)部文石晶片和有機質(zhì)沒有發(fā)生完全解離，被認為這是影響其降解的主要原因之一。如前所述，由于珍珠層的降解方式主要是建立在非特異性的理化溶解方式上的，可以認為隨著珍珠層的粒

5、度進一步下降，將會更有利于其降解。 隨著材料學的不斷發(fā)展，應用納米技術(shù)制備的生物活性材制-納米人工骨也隨之誕生，這種新材料的內(nèi)部結(jié)構(gòu)與天然骨相似，有助于體內(nèi)的細胞及大分子對其進行識別，從而使得材料的生物活性、利用度和生物相容性得以提高。經(jīng)過初步的實驗研究發(fā)現(xiàn)，納米材料具有良好的生物相容性及骨引導活性，其生物活性優(yōu)于微米材料。同時，由于納米材料中的納米粒子所具有的量子尺寸效應、小尺寸效應、表面效應和宏觀量子隧道效應的特點，其降解性

6、能也因此而得到了提高。 本實驗研究是在本課題組前期研究的基礎上，將機械研磨法獲得的納米珍珠層粉與消旋聚乳酸，采用與以往相同的制備工藝，即溶劑澆鑄、熱壓鑄模、溶質(zhì)瀝濾的工序，復合成多孔結(jié)構(gòu)的納米級珍珠層粉/消旋聚乳酸復合人工骨，由于機械研磨法制得的納米珍珠層粉具有保留其原有活性成分的效果，并且其產(chǎn)生的弱堿性的環(huán)境與消旋聚乳酸降解后的弱酸性產(chǎn)物發(fā)生中和，從理論上分析將有利于這種新材料的降解吸收；將納米級珍珠層粉／消旋聚乳酸復合人工骨

7、與以往的微米級珍珠層粉／消旋聚乳酸復合人工骨進行比較研究，從材料表征和理化特性、體外細胞學試驗以及動物體內(nèi)植入試驗等各個方面進行全面分析，旨在探討這一新型天然納米材料納米珍珠層粉，與人工合成高分子生物材料消旋聚乳酸相結(jié)合，所制作的復合人工骨的生物學效應和生物降解能力，為其推廣應用提供實驗依據(jù)。 目的： 1.探討納米珍珠層人工骨與微米珍珠層人工骨相比之下的性能變化及其應用的合理性； 2.研究納米珍珠層人工骨與成骨細

8、胞的生物相容性； 3.觀察納米級珍珠層粉在大鼠骨缺損區(qū)的降解吸收情況和以其為原材料制作的復合人工骨在大鼠體內(nèi)的生物相容性； 4.觀察納米珍珠層人工骨修復兔橈骨缺損的作用。 方法： 1.材料制備：采用機械研磨法獲得納米級珍珠層粉，與消旋聚乳酸復合，按照溶劑澆鑄、熱壓鑄模、溶質(zhì)瀝濾的工序，制成中空圓柱體的納米級珍珠層粉/消旋聚乳酸復合人工骨，同法制作出實心圓柱體的微米級珍珠層粉/消旋聚乳酸復合人工骨。

9、 2.材料表征測定：通過掃描電子顯微鏡觀察納米級珍珠層粉與微米級珍珠層粉的實際粒徑、以及這兩種原材料制得的納米珍珠層復合人工骨和微米珍珠層復合人工骨的孔徑，采用比重法測量兩種人工骨的孔隙率，并采用MTS858萬能力學實驗機對這兩種人工骨進行生物力學強度的檢測，對以上檢測結(jié)果進行對比分析。 3.體外細胞學實驗：納米珍珠層/消旋聚乳酸復合人工骨與微米珍珠層／消旋聚乳酸復合人工骨分別與傳至第3代的成骨細胞共培養(yǎng)，在倒置相差顯微鏡下觀察

10、成骨細胞貼附情況，在掃描電子顯微鏡下觀察成骨細胞在材料上生長情況，用CCK-8法檢測成骨細胞與人工骨材料共培養(yǎng)1、3、5、7天后的增殖情況，共培養(yǎng)7天后，BCA法測定細胞蛋白含量，AKP試劑盒測定細胞堿性磷酸酶活性。 4.原材料粉體及人工骨片體內(nèi)植入實驗：將納米珍珠層粉及其與消旋聚乳酸復合制得的人工骨片，分別植入大鼠股骨骨洞及股部肌囊，同時與微米珍珠層粉及其復合人工骨作對照，并建立空白對照。于術(shù)后當天及第2、4、8周分別作X-r

11、ay攝片檢查，動物處死前予四環(huán)素注射作活體熒光標記，處死后行大體、組織學及掃描電鏡觀察。 5.人工骨植入體內(nèi)修復大段骨缺損實驗：將納米珍珠層/消旋聚乳酸復合人工骨植入新西蘭白兔1.5cm的橈骨缺損區(qū)，同時與微米珍珠層／消旋聚乳酸復合人工骨作對照，并設立空白對照。分別于術(shù)后當天及4、8、16、24周作X線、骨密度測量，動物處死前予四環(huán)素注射作活體熒光標記，然后動物取材作大體及組織學檢查。 結(jié)論： 1.納米珍珠層人工

12、骨的制備原料納米珍珠層粉采用機械球磨法制作，其粉體粒徑達到納米級顆粒的要求。納米珍珠層／消旋聚乳酸復合人工骨具有良好的孔徑及孔隙率，其生物力學特性達到了人工骨植入的性能指標要求。 2.帶有中空孔道的納米珍珠層／消旋聚乳酸復合人工骨在制備上更為合理，這種結(jié)構(gòu)可以有效避免發(fā)生溶質(zhì)濾出不徹底的問題。中空體的納米珍珠層／消旋聚乳酸復合人工骨可增加人工骨材料與植入部位內(nèi)環(huán)境的接觸面，有利于內(nèi)部物質(zhì)的交換，并且在必要時還可以作為促骨生長因子

13、以及藥物的承載空間。 3.納米珍珠層／消旋聚乳酸復合人工骨屬于一種無細胞毒性的納米材料，具有良好的生物相容性，對成骨細胞的生長、增殖與分化功能無不良影響，并且在一定程度上促進了成骨細胞的功能，利于細胞的粘附與生長；同時，這種復合人工骨還具有良好的骨傳導功能。 4.納米珍珠層粉較微米珍珠層粉在體內(nèi)具有更好的生物降解性能，這種材料的生物降解作用主要是發(fā)生在非特異性理化溶解的方式之上的。并且，納米珍珠層粉的誘導成骨、促進骨組織