血管內(nèi)皮生長因子-納米陶瓷復(fù)合人工骨的實驗研究.pdf

1、目的： (1)采用材料直接與細(xì)胞因子復(fù)合的方法，探求該實驗所用的納米陶瓷人工骨能復(fù)合的最大VEGF的量及其在體外的緩釋規(guī)律。 (2)觀察復(fù)合有不同濃度的VEGF的納米陶瓷人工骨在體外促進(jìn)兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞貼附、增殖和成骨的能力及其與VEGF的濃度的相關(guān)性。 (3)用實驗證明改進(jìn)后的兔橈骨中上段骨缺損模型是一種理想的完全骨缺損動物模型． (4)研究復(fù)合有VEGF的納米陶瓷人工骨修復(fù)兔兔橈骨完全性骨缺損的效果并

2、探求其作用機理和特點。 (5)探討納米陶瓷人工骨移植在骨缺損修復(fù)中的重建效果及接骨七厘片促進(jìn)其成骨的作用。 方法： (1)將不同量的(400ng、350ng、300ng、250ng、200ng)VEGF粉末制成的溶液滴加到納米陶瓷人工骨條上，置于恒溫箱中過夜。接著用緩釋液泡洗3次，以除去沒有復(fù)合和復(fù)合不牢的VEGF。將每次的泡洗液收集起來，用ELISA法測其中的VEGF的量，通過計算即可得復(fù)合到人工骨內(nèi)VEGF的

3、量。將復(fù)合了VEGF的人工骨條浸泡在含胎牛血清的PBS緩釋液中。于2小時后及此后的每24小時換液一次，將換出的液體分別收集起來，用ELISA法測量其中VEGF的量． (2)根據(jù)復(fù)合的VEGF的不同濃度，分為5組，每組復(fù)合人工骨分別與傳代培養(yǎng)后的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)，在不同時相點檢測細(xì)胞上架率、增殖細(xì)胞計數(shù)、堿性磷酸酶的活性、掃描電鏡觀察及成骨面積計算。 (3)在文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，選擇兔橈骨中上段完全骨缺損模型為實驗

4、動物模型，并改進(jìn)其制作方法。以自體骨移植為對照，在術(shù)后不同時期觀察傷口愈合、肢體活動情況；大體標(biāo)本觀察植骨愈合情況、骨質(zhì)量、解剖斷面、植骨的骨和軟組織界面情況；X線觀察骨質(zhì)密度、數(shù)量等；觀察組織形態(tài)學(xué)變化． (4)在前述的研究基礎(chǔ)上，選擇復(fù)合有VEGF300ng/cm3的納米陶瓷人工骨為實驗組(A組)，以復(fù)合有BMP的納米陶瓷人工骨(B組)及單純納米陶瓷人工骨(C組)為對照組，進(jìn)行動物體內(nèi)成骨實驗，在術(shù)后不同時期行血液中VEGF

5、和堿性磷酸酶的含量的檢測、免疫組化VEGF受體染色檢測局部含VEGF的受體的細(xì)胞的數(shù)量、免疫組化血管染色檢測局部血管的數(shù)量、X線觀察、組織學(xué)觀察及成骨體積計算。 (5)2005年3月-2007年11月應(yīng)用納米陶瓷人工骨治療四肢骨缺損病例43例，隨機分為兩組，一組為單純應(yīng)用納米陶瓷人工骨組(A組，23例)，另一組同時口服接骨七厘片(B組，20例)．于術(shù)后第1、2周及第1、3、6個月檢測外周靜脈血中B_ALP的含量，于術(shù)后一周內(nèi)、第

6、1、3、6、12、18、24個月拍X線片，并作Lane-Sandhu X線評分的比較． 結(jié)果： (1)400ng組和350ng組復(fù)合到人工骨上的VEGF的量相近，而350ng以下各組復(fù)合到人工骨上的VEGF的量隨著加入的VEGF的量的增加而增加，并且兩者呈正相關(guān)；復(fù)合到納米陶瓷人工骨上的不同濃度的VEGF在PBS溶液中均能緩慢釋放VEGF約十天，開始時釋放的量較大，隨后迅速減少，于第2天后逐漸趨于平穩(wěn)，并且釋放的VEGF

7、的量與復(fù)合的VEGF的濃度成正相關(guān)． (2)體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)復(fù)合有VEGF 的各組細(xì)胞上架率較E組明顯要高(P<0.05)，但A組、B組、C組和D組間的差別不明顯(P>0.05)；掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)復(fù)合有VEGF的各組在第3、7、14天成骨均比E組要多且發(fā)生得要早，并且與VEGF得濃度有正相關(guān)性，即不同時期成骨的量A組>B組>C組>D組；增殖細(xì)胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)在各個時間點，細(xì)胞數(shù)A組>B組>C組>D組>E組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0

8、.05)；A、B、C、D組均明顯高于E組(P<0.01)；在相同時相點，堿性磷酸酶的活力測定發(fā)現(xiàn)，A組>B組>C組>D組>E組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；A、B、C、D組均明顯高于E組(P<0.01)；分別在第3、7.14天測各組支架表面成骨面積，結(jié)果隨著時間的延長，各組成骨都明顯增多(P<0.01)；在各個時相點，A、B、C、D組均明顯比E組多(P<0.01)，并且A組>B組>C組>D組(P<0.05)。 (3)所有動

9、物的傷口均能順利的I期愈合，傷肢活動基本正常；在第2、4、8、12周時，大體標(biāo)本觀察發(fā)現(xiàn)空白實驗組只有纖維組織長入，骨缺損不能愈合，而自體骨移植組在第8周時就基本愈合，第12周外觀和質(zhì)地與宿主骨相近；x線觀察發(fā)現(xiàn)術(shù)后12周時自體骨對照組骨缺損區(qū)密度較高，均勻一致，接近正常皮質(zhì)骨密度，骨缺損被修復(fù)，空白實驗組骨缺損周圍出現(xiàn)輕度硬化，髓腔內(nèi)呈現(xiàn)低密度影，骨缺損未被修復(fù)；組織學(xué)觀察結(jié)果，空白實驗組在不同時期只有纖維組織長入，僅靠近宿主骨的兩端

10、有少量骨痂，自體骨對照組自第2周就有軟骨化骨發(fā)生，到第12周時骨缺損區(qū)域再生的骨組織填充，并發(fā)生骨塑型，骨髓腔部分再通。 (4)術(shù)后傷口順利愈合，肢體活動自如，術(shù)后第2周時見人工骨周圍未形成炎性包膜，無炎性滲液，第4周取材時，A組和B組植入材料的體積明顯縮小，與正常骨組織結(jié)合緊密，C組材料的體積未見明顯縮小，與正常骨組織結(jié)合疏松，8周時A組和B組材料進(jìn)一步降解，表面大部分被骨質(zhì)包繞，C組材料部分降解，12周A組和B組材料幾乎完全

11、降解，而且其外觀也同周圍骨組織相似，C組材料仍有部分未降解；術(shù)后血清堿性磷酸酶結(jié)果，術(shù)后較之術(shù)前各組都明顯增高(P<0.05)。4周內(nèi)比較：A組>B組>C組；術(shù)后4至8周內(nèi)比較：B組>A組>C組；術(shù)后12周時比較： C組>B組>A組；血清中血管內(nèi)皮生長因子的濃度結(jié)果是，術(shù)后各時相點較術(shù)前明顯增高(P<0.05)；A組在術(shù)后都低于B組和C組(P<0.05)，2周內(nèi)尤為明顯；術(shù)后X線檢查發(fā)現(xiàn)，材料降解A組略快于B組，明顯快于C組，骨生成發(fā)生

12、的先后順序是A組、B組和C組；X線骨形成及塑形定量評分示各組術(shù)后X線評分逐漸升高(P<0.05)，自術(shù)后第2周到4周，A組評分高于B組，明顯高于C組(P<0.05)，8周后A組與B組間差異不明顯(P>0.05),仍高于C組，組織學(xué)切片見，在第8周前，A組材料的降解和骨的生成快和多于B組及C組，發(fā)生在材料的孔隙內(nèi)的降解和骨生成也明顯早于B組和C組；成骨體積計算，結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后各組成骨逐漸增多(P<0.05)，A組在8周前成骨都明顯多于B組和

13、C組(P<0.05)；Lane-Sandhu組織學(xué)評分，各組內(nèi)隨著時間的推移，組織學(xué)評分逐漸升高，有顯著差異(P<0.05)，而在不同時期，A組>B組>C組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而在早期(8周前)A組評分的增長比B組和C組都要快，但最終A組和B組的結(jié)果相近(P>0.05)；免疫組化血管染色切片發(fā)現(xiàn)，A組在早期就有血管向材料的孔隙內(nèi)長入，明顯早于B組和C組；血管計數(shù)發(fā)現(xiàn)A組在早期(術(shù)后2天)即有大量的血管生成，明顯多于B

14、組和C組(P<0.01)，4周前A組組內(nèi)比較逐漸升高(P<0.05)，8周后逐漸下降(P<0.05)，4周及以前，各組組間比較A組>B組>C組(P<0.01)，12周時組間比較B組>C組>A組(P<0.05)；免疫組化法VEGF受體染色及被染色的細(xì)胞計數(shù)，發(fā)現(xiàn)第2天時A組即可見有被染色的細(xì)胞聚于人工骨孔隙內(nèi)，而交界處更可見大量的胞漿被染色的成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，染色細(xì)胞計數(shù)見，4周前A組組內(nèi)比較逐漸升高(P<0.05)，4周后逐漸下降(P

15、<0.05)；4周及以前，各組組間比較A組>B組>C組(P<0.01)，8周后組間比較B組>A組>C組(P<0.05)。 (5)接骨七厘片能促進(jìn)納米陶瓷人工骨植入后機體內(nèi)的骨代謝，隨訪9~24個月，平均15個月．X線片顯示A組1～3個月開始出現(xiàn)骨痂生長，平均愈合時間：骨干為18個月，干骺端為10個月；B組的平均愈合時間縮短． 結(jié)論： (1)采用本文的復(fù)合方法，能復(fù)合到該納米陶瓷人工骨上的VEGF的最大量為300n

16、g/Cm3，在這個濃度以下隨著VEGF的量的增加，復(fù)合到人工骨的VEGF的量也會增加，并且兩者呈正相關(guān)。復(fù)合到納米陶瓷人工骨上的’VEGF在體外的PBS緩釋溶液中能緩慢釋放約十天，開始的量較大，隨后迅速減少，于第2天后逐漸趨于平穩(wěn)，并且釋放的VEGF的量與復(fù)合的VEGF的量成正相關(guān)． (2)VEGF能促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在該納米陶瓷人工骨支架上的粘附，能明顯促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖，增強其成骨活性和增加成骨，并且在150ng/cm