堿性磷酸酶在牙鲆發(fā)育變態(tài)中的表達(dá)圖式及功能研究.pdf

1、牙鲆早期發(fā)育經(jīng)歷一個(gè)典型的變態(tài)過(guò)程，其身體從兩側(cè)對(duì)稱變成兩側(cè)不對(duì)稱，外形上最大的變化是右眼移到身體的左側(cè)。同時(shí)，其背鰭、骨骼肌、胃腺、紅細(xì)胞等在細(xì)胞和分子水平上也發(fā)生明顯變化。甲狀腺素在這些變化中起到核心的調(diào)控作用。除甲狀腺素外，堿性磷酸酶(ALP)也是脊椎動(dòng)物發(fā)育中的一個(gè)關(guān)鍵因子，參與多種生理活動(dòng)，特別是骨骼的發(fā)育。ALP與甲狀腺素關(guān)系密切，已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)證明人腸ALP是由甲狀腺素受體直接調(diào)控的靶基因。為探討ALP在牙鲆仔魚(yú)發(fā)育中的功能、

2、基因表達(dá)及其與甲狀腺素的關(guān)系，本文采用組織學(xué)、分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的方法對(duì)牙鲆ALP進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究。 1、牙鲆ALP表達(dá)圖式與消化道發(fā)育 原腸期胚體中即可以檢測(cè)到ALP的活性，位于胚體的周圍區(qū)域，無(wú)明顯的分節(jié)現(xiàn)象，卵黃中始終沒(méi)有酶活性。出膜后，在頭和背部的分布比較多，而在身體的中部?jī)?nèi)臟區(qū)域，分布較少。出膜后的仔魚(yú)至進(jìn)食后，ALP開(kāi)始在消化道中大量的表達(dá)，特別是在胃腸道粘膜層。 消化道作為ALP分布最集中的

3、部位，不僅是一個(gè)消化吸收器官，也是一個(gè)免疫和內(nèi)分泌的器官。本文首先對(duì)其發(fā)育進(jìn)行了組織學(xué)觀察。出膜后3天內(nèi)，消化道不斷延長(zhǎng)并且和卵黃共存，腸開(kāi)始分化。卵黃也越來(lái)越小，第5天卵黃基本消失，肝臟初步發(fā)育，位于腸的上方。出膜后15天，變態(tài)發(fā)育開(kāi)始，消化道已經(jīng)分化為口、咽、食道、胃前體、腸和后腸。胰臟位于腸的環(huán)繞中。杯狀細(xì)胞在消化道大多數(shù)部位都有分布。5-羥色氨細(xì)胞、胃泌素細(xì)胞和P物質(zhì)細(xì)胞三種內(nèi)分泌細(xì)胞很少且形狀不規(guī)則。第30天，消化道分化完全，

4、胃上皮發(fā)育成柱狀上皮，杯狀細(xì)胞減少，可見(jiàn)胃腺，標(biāo)志胃成熟。胃盲囊也出現(xiàn)。內(nèi)分泌細(xì)胞在胃腸中增多，但個(gè)體間存在一定的差異。第50天，幼魚(yú)消化道發(fā)育比較成熟，管壁的結(jié)構(gòu)完整，三種內(nèi)分泌細(xì)胞分布部位出現(xiàn)分化，幼魚(yú)的肝臟和胰臟仍在進(jìn)一步發(fā)育。牙鲆消化道和高等脊椎動(dòng)物類似，分為食道、胃、胃盲囊和腸。腸也可分為前腸、中腸和后腸。三者之間沒(méi)有明顯的界限。胃和前腸是消化吸收主要的區(qū)域。胃盲囊和前腸結(jié)構(gòu)和功能非常類似。5.羥色氨細(xì)胞和P物質(zhì)細(xì)胞在牙鲆胃前

5、部的粘膜中零星分布，在胃體中較多見(jiàn)，平均每10<'4>μm<'2>胃體粘膜上皮約各有2.2和2.0個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞。而胃泌素細(xì)胞分布在胃盲囊和前腸中，平均每10<'4>μm<'2>粘膜上皮分別有0.98個(gè)和0.71個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞。 2、LP cDNA全長(zhǎng)克隆與ALP序列分析 牙鲆ALP cDNA全長(zhǎng)為1811bp，預(yù)測(cè)能編碼476個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為52293.1Da，等電點(diǎn)為7.67。編碼區(qū)核苷酸GC含量在ALP同源基因

6、中差異比較大，脊椎動(dòng)物明顯高于非脊椎動(dòng)物和細(xì)菌。由蛋白序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹(shù)顯示，牙鲆ALP和青黑斑河豚(Tetraodon，nigroviridis)、斑馬魚(yú)(Danio rerio)的組織非特異性ALP有較高的同源性，分子進(jìn)化樹(shù)和物種進(jìn)化樹(shù)是一致的。在蛋白序列中的一些重要的功能位點(diǎn)，包括金屬離子結(jié)合位點(diǎn)、N糖基化位點(diǎn)和絲氨酸磷酸化位點(diǎn)等表現(xiàn)了較高的保守性。 本研究從Swiss-prot等數(shù)據(jù)庫(kù)中共搜集385條ALP蛋白質(zhì)序列。

7、古細(xì)菌有6種，原核生物有228種，真核生物有151種。整個(gè)序列庫(kù)中ALP蛋白序列平均長(zhǎng)度為514.5個(gè)氨基酸。原核的序列要短于平均序列長(zhǎng)度，為499.3個(gè)氨基酸，其中最短的為287個(gè)氨基酸，最長(zhǎng)的為844個(gè)氨基酸。而古細(xì)菌和真核生物的長(zhǎng)度接近，為536.5個(gè)氨基酸，真核生物比原核的平均長(zhǎng)度要長(zhǎng)且表現(xiàn)了更寬的變化范圍，提示可能是由于酶進(jìn)化過(guò)程中基因重復(fù)產(chǎn)生或丟失次要部分而產(chǎn)生較大的多態(tài)性，是真核生物的酶為發(fā)揮更精細(xì)的功能的需要。選取2S條

8、ALP基因編碼區(qū)偏好使用的密碼子有18個(gè)均為G和C結(jié)尾。僅有Phe的同義密碼子沒(méi)有偏好性。 將通過(guò)折疊子預(yù)測(cè)方法構(gòu)建的牙鲆和產(chǎn)甲烷菌ALP 3D結(jié)構(gòu)和人PALP、大腸桿菌ALP 3D結(jié)構(gòu)比較后發(fā)現(xiàn)，其結(jié)構(gòu)的核心區(qū)仍然保持較高的相似性，其中位于兩個(gè)Zn離子和一個(gè)Mg離子周圍的14個(gè)關(guān)鍵氨基酸中僅有4個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)了多態(tài)性。這些位點(diǎn)可能對(duì)于酶的活性差異產(chǎn)生重要的影響。而比較四種ALP的半胱氨酸空間位置后發(fā)現(xiàn)，牙鲆ALP中可能只存在一個(gè)二

9、硫鍵，產(chǎn)甲烷菌中可能沒(méi)有二硫鍵。人PALP、大腸桿菌的半胱氨酸空間位置差距較大，沒(méi)有表現(xiàn)出同源性。 3、牙鲆發(fā)育中ALP的功能及其與甲狀腺素關(guān)系 變態(tài)前的仔魚(yú)身體總ALP活力約為出膜前后的卵中酶活力的4倍，在變態(tài)期酶活力變化不大，但是在變態(tài)后期上升明顯。T4在變態(tài)中前期對(duì)酶活力有明顯的促進(jìn)作用。TU和TRM均能降低仔魚(yú)體內(nèi)酶活力。TRM處理組的仔魚(yú)消化功能和頭部骨骼的發(fā)育受到一定的影響，消化道內(nèi)食物很少，消化道上皮層中A

10、LP免疫顯色反應(yīng)減弱；頭部骨骼中發(fā)現(xiàn)較多骨細(xì)胞死亡而只留下一些細(xì)胞碎片；超過(guò)95％的仔魚(yú)不能完成右眼的移位就發(fā)生死亡，變態(tài)比較遲緩。 采用RT-PCR和定量PCR的方法在牙鲆卵到出膜后5天的時(shí)候不能檢測(cè)到ALP基因表達(dá)，到變態(tài)前期的仔魚(yú)體內(nèi)開(kāi)始表達(dá)。在胃、肝、鰓、皮膚、皮下肌肉、腎中均能檢測(cè)到ALP基因的表達(dá)。變態(tài)中期表達(dá)量只有初期的1/2，變態(tài)后期卻明顯上升到初期的2．5倍，T4和TU處理對(duì)ALP表達(dá)產(chǎn)生的影響在中期和后期表現(xiàn)

11、明顯。中期T4組明顯高與對(duì)照組和TU組，變態(tài)后期T4組和TU組均低于對(duì)照組。TRαA和TRαB在變態(tài)中均有一個(gè)高峰時(shí)期，但前者在變態(tài)后期下降，后者則依然保持一定的水平。TRβ表達(dá)量變化范圍最大，不同藥物處理產(chǎn)生的結(jié)果差異也很明顯。外源性的T4和T4合成抑制劑TU對(duì)ALP的活性和基因表達(dá)均產(chǎn)生較大的影響，結(jié)果表明T4對(duì)ALP存在調(diào)控的關(guān)系。 牙鲆ALP基因啟動(dòng)子區(qū)的950bp經(jīng)過(guò)軟件預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于翻譯起始密碼予ATG上游1