腫瘤抑制基因CADM1在肝癌中的表達調控及其功能研究.pdf

1、肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見惡性腫瘤之一,在世界范圍內腫瘤致死原因排第3位,導致每年約60萬人死亡。我國是個乙肝大國,乙肝病毒攜帶率在國民中很高。作為肝炎-肝硬化-肝癌這一發(fā)展鏈的終末端,肝癌在我國的高發(fā)成為無可爭辯的事實,從而使我國成為全世界肝癌的最高發(fā)地區(qū)之一。與肝癌發(fā)生相關的主要危險因素有酗酒、黃曲霉素攝入、HBV感染和HCV感染等。隨著人類基因組學的長足發(fā)展和對腫瘤認識的不斷深入,

2、人們意識到腫瘤發(fā)生發(fā)展是個極其復雜的過程,眾多基因的變化和表觀遺傳學等的改變涉及其中。綜合目前對肝癌的研究進展,我們尚不能對其發(fā)生發(fā)展的分子機制做出科學合理的解釋。所以對肝癌形成發(fā)展機制的深入挖掘,鑒定并發(fā)展肝癌治療的新靶標具有重要的意義。
　　 隨著外科技術的發(fā)展,肝移植已經(jīng)被人們接受成為治愈肝癌的最好治療方案之一,但是部分病人肝移植后肝癌復發(fā)的現(xiàn)實依舊成為制約受者長期存活的瓶頸因素。應用理想生物指標將患者進行分類,可幫助臨床

3、醫(yī)生鑒定出術后易轉移復發(fā)病例,并提供個性化的干預治療,以改善病人的預后。圍繞腫瘤復發(fā)轉移這一熱點問題,大量預測肝癌復發(fā)的生物學標記鑒定研究已經(jīng)開展,到目前為止,尚未發(fā)現(xiàn)能夠廣泛應用于臨床的可靠的預后預測指標。
　　 表觀遺傳學的改變是參與腫瘤發(fā)生發(fā)展中的一個重要事件。作為表觀遺傳學的重要研究內容,DNA甲基化導致腫瘤抑制基因的失活被認為是導致腫瘤發(fā)生的早期機制之一。腫瘤抑制基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化在腫瘤細胞的生長、細胞黏附、

4、細胞凋亡、DAN修復和腫瘤血管生成等的過程中發(fā)揮重要的作用。近年來大量的研究報道了DNA甲基化在腫瘤患者預后中的預測作用,其作為一類生物標記已顯示出良好的應用前景。細胞黏附分子1(Cell adhesion molecule l,CADM1)是最近通過功能互補試驗而在人類非小細胞肺癌中鑒定為腫瘤抑制基因。大量的證據(jù)表明CADM1參與了人類眾多腫瘤的形成與發(fā)展。在本課題中,我們首次檢測了CADM1在肝癌中的表達,探討影響其表達的調控機制,

5、嘗試揭示其腫瘤抑制的可能機制,最后評估其在肝移植術后肝癌復發(fā)預測中的價值。
　　 第一部分腫瘤抑制基因CADM1的表達調控及啟動子區(qū)DNA甲基化對肝移植后肝癌復發(fā)預測的價值研究。
　　 目的:
　　 肝移植是肝癌患者最佳治療選擇之一,但大約20％-40％的患者在移植5年內會經(jīng)歷肝癌的復發(fā)。目前尚無可靠的生物學標記可以做出分類,篩選出高危易復發(fā)病例。本實驗的目的是檢測CADM1在肝癌細胞株和臨床標本中的表達,嘗試闡

6、述影響其表達的分子機制；同時檢測肝癌細胞株和臨床標本中CADM1啟動子區(qū)甲基化的狀態(tài),并評估其在肝移植后肝癌復發(fā)預測中的價值。
　　 方法:
　　 應用RT-PCR和免疫組化(immunollistochemistry,IHC)方法檢測CADM1在肝癌細胞株和臨床標本中mRNA和蛋白水平的表達情況。RT-PCR檢測甲基化酶抑制劑(5’-Aza-dC)用藥前后肝癌細胞株中CADM1的mRNA表達水平；并應用基因掃描檢測肝癌

7、臨床標本中的雜合性缺失(Loss of heterozygosity,LOH)情況,探討影響其表達的調控機制。采用重亞硫酸氫鹽修飾測序PCR(Bisulfite sequencingPolymerase Chain Reaction,BSP)的方法首先檢測10株肝癌細胞株和2株永生化正常肝細胞株中CADM1基因甲基化狀況,之后通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)結合定點突變技術確定CADM1基因的核心啟動子區(qū),針對該區(qū)域采用結合重亞硫酸氫鹽的限制性內

8、切酶法(COBRA)檢測了82對臨床肝癌組織中CADM1的甲基化狀態(tài)。最后收集肝癌肝移植病人臨床病理資料及隨訪資料,比較不同CADM1甲基化表型與病人臨床病理指標及移植術后復發(fā)生存之間的關系。
　　 結果:
　　 CADM1異常甲基化在肝癌細胞株中發(fā)生的比例為50％(5／10),同時常伴有mRNA表達水平下降。應用甲基化酶抑制劑5’-Aza-dC作用肝癌細胞株后,CADM1的表達得到恢復或明顯增強。LOH在肝癌組織中的發(fā)

9、生比例為13.8％(4／29)。CADM1的核心啟動子序列位于轉錄起始位點前-146 bp至-226 bp,位于該區(qū)域中的Sp1結合元件在CADM1基因的轉錄過程中可能發(fā)揮重要的作用。針對該區(qū)域的甲基化檢測發(fā)現(xiàn),CADM1甲基化在臨床肝癌標本中的發(fā)生率為41.5％(34／82)。CADM1異常甲基化病例移植后腫瘤復發(fā)的發(fā)生概率明顯高于非甲基化病例(70.6％versus33.3％；P=0.001)。多因素分析提示CADM1甲基化是肝癌肝

10、移植術后腫瘤復發(fā)的獨立危險因素(HR=2.788；95％CI,1.043-5.063；P=0.010)。
　　 結論:
　　 在肝癌中,啟動子區(qū)DNA甲基化是導致CADM1表達下調的主要調控機制。CADM1啟動子區(qū)甲基化是影響移植后肝癌復發(fā)的獨立危險因素,對移植后腫瘤復發(fā)的預測具有潛在的重要價值。
　　 第二部分腫瘤抑制基因CADM1在肝細胞肝癌中的抑癌作用及其機制的實驗研究。
　　 目的:
　　

11、 隨著對CADM1基因研究的深入開展,越來越多的證據(jù)顯示它和多數(shù)的人類腫瘤形成相關。在本課題中我們應用了一系列的細胞生物學實驗來驗證CADM1在肝癌形成發(fā)展中的作用,并分別采用體外和體內的實驗方法嘗試闡述CADM1在肝癌中作為腫瘤抑制基因的潛在機制。
　　 方法:
　　 為了評估CADM1在肝癌形成發(fā)展中的作用,我們首先成功構建了該基因的真核表達載體,之后采用了一系列的細胞學功能實驗方法,包括CCK-8增殖抑制實驗、Ed

12、U摻入增殖實驗、細胞周期實驗、克隆形成實驗和裸鼠體內腫瘤形成實驗。最后應用Western blot和siRNA等實驗方法對CADM1的腫瘤抑制作用的潛在機制作出探討。
　　 結果:
　　 應用克隆技術,我們成功構建了CADM1的真核表達載體。在低表達CADM1的肝癌細胞株HepG2和MHCC-97L中,異位表達的CADM1顯著抑制了腫瘤細胞的增殖,并使細胞增殖停滯于G0／G1期。同時,異位表達的CADM1明顯抑制了腫瘤細

13、胞體外形成克隆的能力；在體內,穩(wěn)定轉染CADM1表達載體的MHCC-97L細胞種植的裸鼠皮下腫瘤形成數(shù)目明顯低于空載體組(4／8 versus8／8)。Western blot實驗結果顯示,Rb蛋白的表達豐度隨著CADM1的表達量的上調而增加,同時在臨床肝癌標本中CADM1蛋白的表達與Rb蛋白的表達顯示出較為明顯的一致性。在高表達CADM1蛋白的BEL-7402細胞中,我們應用siRNA敲除技術后發(fā)現(xiàn),CADM1蛋白沉默同時也伴有Rb蛋