新基因MR-1在肝癌細胞中的功能研究.pdf

1、肌原纖維形成調(diào)節(jié)因子1(Myofibrillogenesisregulator1，MR-1)是一種新發(fā)現(xiàn)的人類功能基因，以往研究表明MR-1與心肌細胞重構(gòu)、收縮及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程相關(guān)，該基因在心肌肥大細胞和白血病細胞中高表達。闡明該基因在腫瘤發(fā)生以及細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用及其機理，將有助于腫瘤的診斷與防治。本研究主要目的是探索MR-1基因在腫瘤細胞增殖、粘附和遷移過程中的作用及機制，闡明MR-1作為一個腫瘤治療的新靶點的可行性。研究結(jié)果

2、如下： 1.MR-1在腫瘤細胞中的表達與定位 對人正常細胞以及不同腫瘤細胞中MR-1mRNA以及蛋白進行檢測，結(jié)果表明，在人腫瘤細胞中MR-1的表達高于正常細胞，提示MR-1有可能為腫瘤相關(guān)基因。其中人肝癌細胞HepG2表達水平最高。我們構(gòu)建了MR-1和綠色熒光蛋白融合表達的載體，并將它轉(zhuǎn)染HepG2細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MR-1和綠色熒光融合蛋白主要表達于細胞質(zhì)中。 2.MR-1表達下調(diào)引起的細胞生物學(xué)行為改變

3、 RNA干擾技術(shù)主要通過外源導(dǎo)入與靶基因mRNA互補的雙鏈RNA，從而抑制靶基因的蛋白表達。本研究選取MR-1表達水平最高的HepG2細胞，通過化學(xué)合成的21個核苷酸的短干擾核糖核酸(siRNA)干擾降低HepG2細胞中MR-1的表達水平，觀察細胞生物學(xué)行為發(fā)生的變化。根據(jù)siRNA設(shè)計原理，設(shè)計并合成了2個siRNA干擾序列。轉(zhuǎn)染細胞36小時后檢測細胞內(nèi)MR-1蛋白的表達水平，選擇抑制效果最好的序列，進行后續(xù)工作的研究。 生長

4、曲線法以及克隆形成實驗檢測MR-1-siRNA對HepG2細胞增殖速率的影響。結(jié)果顯示，經(jīng)MR-1-siRNA處理后，HepG2細胞生長速度明顯減慢，克隆形成率抑制率為66.81％。Transwell實驗檢測MR-1-siRNA對HepG2細胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示，經(jīng)siRNA處理后，細胞3小時內(nèi)穿過8μm濾膜的細胞數(shù)明顯減少，為對照組細胞數(shù)的37.27％。細胞基質(zhì)粘附試驗檢測MR-1-siRNA對細胞與基質(zhì)之間粘附能力的影響。結(jié)果

5、顯示，經(jīng)MR-1-siRNA處理后，細胞對纖維粘連蛋白(FN)的粘附能力下降。結(jié)果說明MR-1可促進腫瘤細胞的生長，運動以及粘附。 3.HepG2/MR-1(-)細胞的生物學(xué)行為改變 我們構(gòu)建了可以穩(wěn)定表達MR-1-shRNA的pCD-sh-MR-1載體，并將它穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細胞，進行單克隆培養(yǎng)后，建立MR-1穩(wěn)定沉默的HepG2/MR-1(-)細胞系。作為對照，建立了HepG2/mock細胞系。 對HepG

6、2/MR-1(-)細胞系的生物學(xué)行為進行檢測，結(jié)果顯示其體外增殖速率顯著降低，克隆形成率抑制率為31.77％；細胞遷移能力明顯下降，抑制率為56.55％：HepG2/MR-1(-)細胞對FN的粘附能力在15～90min培養(yǎng)時間點與HepG2細胞比較明顯下降；另外，HepG2/MR-1(-)細胞在FN上的伸展形態(tài)發(fā)生改變，伸展速度下降。體內(nèi)成瘤性試驗表明，HepG2/MR-1(-)細胞裸鼠皮下移植瘤生長速率與HepG2細胞相比明顯降低，抑

7、制率達91.01％。 4.BEL-7402/MR-1(+)細胞的生物學(xué)行為改變 采用能在真核細胞中高效表達目的基因的質(zhì)粒pcDNA3.1+，我們構(gòu)建了MR-1高表達質(zhì)粒-pcDNA3.1-MR-1。將pcDNA3.1-MR-1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入BEL-7402細胞中，經(jīng)過單克隆挑選，建立BEL-7402/MR-1(+)細胞系，Westernblot法檢測，證明該細胞系中MR-1蛋白的表達水平顯著增加。同時穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1

8、+，建立BEL-7402/EV細胞系。 生長曲線以及克隆形成實驗檢測BEL-7402/MR-1(+)細胞系的增殖速率，結(jié)果顯示BEL-7402/MR-1(+)細胞的增殖速率無明顯改變；劃痕實驗表明BEL-7402/MR-1(+)細胞越過劃痕的能力明顯增強；Transwell試驗亦表明，BEL-7402/MR-1(+)細胞系遷移能力增強29.7％；粘附實驗結(jié)果顯示，BEL-7402/MR-1(+)在10min，20min，30mi

9、n以及60min培養(yǎng)后對FN的粘附率明顯增加；另外，細胞在FN上的伸展速度變快。 5.MR-1在腫瘤增殖、粘附和遷移過程中的作用機制 酵母雙雜交和體外蛋白結(jié)合試驗表明，MR-1可以與肌球蛋白輕鏈2(MLC2)結(jié)合(1)。文獻報道，MLC2的活性與細胞運動以及轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)。MLC2活化后肌球蛋白即可與肌動蛋白結(jié)合，促進張力纖維的聚合，進而增強細胞運動(2’3)。腫瘤細胞的運動轉(zhuǎn)移是一個整體連續(xù)的過程，該過程與細胞與基質(zhì)

10、的粘附有關(guān)(4)。當(dāng)細胞與基質(zhì)發(fā)生粘附后，粘著斑激酶(FAK)激活，F(xiàn)AK可通過磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)細胞存活[5,6]。在此基礎(chǔ)上，我們開展了MR-1的作用機制研究。 (1)MR-1對MLC2、FAK和Akt磷酸化和張力纖維形成的影響 檢測MR-1-siRNA對細胞內(nèi)MLC2磷酸化水平以及張力纖維形成的影響，結(jié)果表明MR-1-siRNA處理后，細胞內(nèi)MLC2蛋白的19位絲氨酸磷酸化水平明顯

11、降低。羅丹明偶聯(lián)鬼筆環(huán)肽染色檢測細胞內(nèi)張力纖維的形成，結(jié)果表明MR-1-siRNA處理后，細胞內(nèi)F-actin的聚集與對照組細胞相比明顯受到抑制。說明MR-1通過某種機制促進MLC2的磷酸化，然后影響F-actin的聚集，進而增強細胞遷移能力。 檢測MR-1-siRNA對FAK以及Akt活性的影響，結(jié)果顯示FAK和Akt的磷酸化水平顯著下降。另外，MR-1-siRNA也可抑制FN激活的FAK/Akt活性。說明MR-1通過影響FA

12、K/Akt活性調(diào)節(jié)細胞粘附以及增殖。 (2)MR-1激活MLC2-FAK-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 采用肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)抑制劑、F-actin解聚劑和PI3K抑制劑處理細胞，檢測MLC2、FAK和Akt磷酸化水平以及張力纖維的形成，闡明這些蛋白在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的相互關(guān)系。結(jié)果顯示，給予MLCK抑制劑后，細胞內(nèi)MLC2磷酸化水平降低，張力纖維形成受抑，同時FAK/Akt活性發(fā)生顯著降低。給予F-actin解聚劑后，M

13、LC2磷酸化水平上升，而FAK/Akt活性降低，這兩組結(jié)果說明活化的MLC2通過促進細胞內(nèi)張力纖維的聚合，作為上游信號因子調(diào)節(jié)FAK/Akt通路。另外，給予上述抑制劑后，細胞遷移能力以及生長能力均出現(xiàn)不同程度的下降。 給予PI3K抑制劑后，除細胞Akt磷酸化水平缺失外，MLC2以及FAK磷酸化水平也發(fā)生不同程度的下降，說明Akt還可通過某種機制促進MLC2活性，從而在細胞內(nèi)形成正反饋信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)細胞粘附、遷移和增殖。而上述

14、三種抑制劑對MR-1表達均無影響。另外，當(dāng)瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MR-1使細胞表達外源性MR-1后，細胞內(nèi)MLC2、FAK和Akt磷酸化水平顯著升高，該作用可被MLCK抑制劑阻斷，說明MR-1為該信號通路的上游調(diào)節(jié)因子。 (3)MR-1對細胞增殖和運動相關(guān)基因表達的影響 采用基因芯片技術(shù)檢測MR-1瞬時沉默細胞以及MR-1高表達細胞中全基因組的變化。HepG2細胞處理30小時后，比較MR-1-siRNA處理細胞與mo

15、ck-siRNA處理細胞之間基因的差異。結(jié)果顯示MR-1-siRNA處理組細胞有326個基因發(fā)生改變，其中192個基因上調(diào)，134個基因發(fā)生下調(diào)。另外，對比BEL-7402/MR-1(+)細胞與BEL-7402/EV細胞中基因的差異。結(jié)果顯示BEL-7402/MR-1(+)細胞有1318個基因發(fā)生了改變，其中338個基因出現(xiàn)上調(diào)，980個基因出現(xiàn)下調(diào)。這些受MR-1影響的基因中有很多與細胞增殖和運動相關(guān)的基因。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因分析表明，