重組激活基因1在杏仁核中的表達及其功能研究.pdf

1、背景:
　　學習和記憶是腦的高級功能。深入研究學習和記憶的機理，對于開發(fā)腦的功能，治療與學習記憶障礙有關的疾病等具有重要的意義。杏仁核是邊緣系統(tǒng)的重要結構之一，與學習記憶、情緒、情感密切相關，而且參與精神分裂癥、抑郁、癲癇和創(chuàng)傷后應激障礙等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程。杏仁核是條件性恐懼記憶形成和儲存的部位，條件性恐懼記憶是由條件刺激和非條件刺激配對訓練而形成的。
　　重組激活基因-1(recombination activa

2、ting gene-1，RAG1)最早在免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，并且與免疫細胞特異性的記憶活動密切相關。它編碼的產(chǎn)物與其他相關蛋白協(xié)同作用，能夠引起V(D)J重排，使得免疫球蛋白和T細胞受體產(chǎn)生高度多樣性。既往國外報道了RAG1基因敲除后可以導致動物的免疫記憶功能缺失，引起重度聯(lián)合免疫缺陷疾病。后來的研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有RAG1的轉錄，并且表達的部位主要集中于海馬、邊緣系統(tǒng)等與學習記憶有關的腦區(qū)，然而RAG1是否與學習和記憶功能有關目前尚

3、未明確。
　　大腦和免疫系統(tǒng)都具有編碼記憶的能力，研究資料也表明腦內(nèi)存在著與免疫系統(tǒng)中相類似的基因重組。為了明確腦內(nèi)RAG1基因的缺失是否會影響學習記憶功能，通過對RAG1敲除小鼠進行研究發(fā)現(xiàn)，RAG1缺失會引起小鼠神經(jīng)行為的改變。然而，用基因敲除技術來研究RAG1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的功能存在著不足之處，因為動物從胚胎期就開始缺失RAG1基因會造成免疫缺陷，對其發(fā)育過程會產(chǎn)生干擾，從而對后續(xù)實驗的結果造成影響。
　　因此本工作

4、采用RNA干擾技術，避開基因敲除技術的弊端，對杏仁核區(qū)RAG1的表達進行了基因沉默，比較研究RAG1基因沉默前后大鼠學習和記憶能力的變化。
　　第一部分、條件性恐懼訓練對大鼠杏仁核內(nèi)RAG1表達的影響
　　目的:
　　檢測條件恐懼訓練后大鼠杏仁核區(qū)RAG1的表達變化。
　　方法與結果:
　　大鼠隨機分為對照組和條件性恐懼實驗組，建立條件恐懼記憶模型，并以呆立時間(freezing time)評價大鼠對條件恐

5、懼事件的記憶。條件恐懼刺激后30min、1h，應用熒光定量PCR對大鼠杏仁核區(qū)RAG1的表達量進行檢測。結果顯示:實驗組大鼠在被重新放入電擊箱后，5min內(nèi)的呆立時間明顯長于相應時間點的對照組，差異具有統(tǒng)計學意義。與對照組相比，實驗組杏仁核內(nèi)RAG1的表達量明顯增加。
　　結論:
　　條件性恐懼訓練會引起大鼠杏仁核區(qū)RAG1表達水平增高。
　　第二部分、大鼠RAG1基因shRNA慢病毒載體的構建與鑒定
　　目的:

6、
　　構建有效的慢病毒載體，并觀察其對RAG1表達的抑制效應。
　　方法與結果:
　　設計針對RAG1基因的最優(yōu)shRNA序列及1對無關序列，經(jīng)單鏈片段的合成和退火后，分別克隆至pMagic4.1載體的酶切位點處，經(jīng)酶切、測序鑒定正確后，將重組質粒與包膜質粒pMD2G、包裝質粒pMDlg/pRRE及REV表達質粒pRSV-Rev共轉染293T細胞，包裝成慢病毒。Real-time PCR方法測定病毒滴度，感染體外培養(yǎng)的

7、大鼠神經(jīng)元后，通過免疫印跡和Real-time PCR檢測RAG1的表達水平。測定LV-shRNA病毒的滴度為2.08×108TU/ml，對照病毒(LV-Negative)的滴度為1.79×109TU/ml。與未感染慢病毒組相比較，慢病毒感染神經(jīng)元后，RAG1的表達水平受到明顯的抑制。
　　結論:
　　根據(jù)RAG1基因序列利用siRNA target finder軟件設計出特異性的shRNA序列。成功構建了慢病毒載體，該載體

8、能有效感染大鼠原代神經(jīng)元并抑制RAG1的表達。
　　第三部分、RNA干擾下調杏仁核RAG1表達對大鼠恐懼記憶的影響
　　目的:
　　觀察RAG1被抑制后是否會影響到恐懼記憶能力，以及隨后觀察杏仁核神經(jīng)元是否有相應的形態(tài)學改變。
　　方法與結果:
　　SD大鼠隨機分為三組:分別為正常對照組，注射干擾病毒組(LV-shRNA)，注射對照病毒組(LV-Negative)。通過腦立體定位儀將慢病毒載體注射到大鼠雙側

9、杏仁核。注射病毒一周后利用RT-PCR檢測慢病毒干擾RAG1mRNA表達的效果，并切片觀察注射區(qū)GFP表達情況。慢病毒注射入杏仁核后，RT-PCR結果顯示RAG1mRNA水平明顯受到抑制。注射慢病毒一周后，不同批次大鼠分別進行行為學測試。Morris水迷宮實驗觀察指標為逃避潛伏期和穿臺次數(shù)，結果顯示注射干擾病毒組與對照組以及注射對照病毒組相比沒有顯著性差異。利用單次被動回避反應測定大鼠的記憶能力，大鼠停留在明室的時間即反應潛時，越長代表

10、大鼠記憶能力越佳。結果顯示，在訓練階段三組動物的反應潛時沒有顯著性差異，在測試階段，LV-shRNA組的反應潛時與對照組、LV-Negative組相比明顯減少。條件性恐懼結果顯示，LV-shRNA組的呆立時間與對照組、LV-Negative組相比明顯減少。各組大鼠在條件性恐懼觀察結束后立即處死，取杏仁核組織制作電鏡包埋和切片，電鏡觀察結果顯示LV-shRNA組杏仁核區(qū)單位面積突觸數(shù)目明顯少于正常組大鼠。
　　結論:
　　慢病