重組激活基因1在杏仁核中的表達(dá)及其功能研究.pdf

1、背景:
　　學(xué)習(xí)和記憶是腦的高級功能。深入研究學(xué)習(xí)和記憶的機(jī)理，對于開發(fā)腦的功能，治療與學(xué)習(xí)記憶障礙有關(guān)的疾病等具有重要的意義。杏仁核是邊緣系統(tǒng)的重要結(jié)構(gòu)之一，與學(xué)習(xí)記憶、情緒、情感密切相關(guān)，而且參與精神分裂癥、抑郁、癲癇和創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程。杏仁核是條件性恐懼記憶形成和儲存的部位，條件性恐懼記憶是由條件刺激和非條件刺激配對訓(xùn)練而形成的。
　　重組激活基因-1(recombination activa

2、ting gene-1，RAG1)最早在免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，并且與免疫細(xì)胞特異性的記憶活動密切相關(guān)。它編碼的產(chǎn)物與其他相關(guān)蛋白協(xié)同作用，能夠引起V(D)J重排，使得免疫球蛋白和T細(xì)胞受體產(chǎn)生高度多樣性。既往國外報(bào)道了RAG1基因敲除后可以導(dǎo)致動物的免疫記憶功能缺失，引起重度聯(lián)合免疫缺陷疾病。后來的研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有RAG1的轉(zhuǎn)錄，并且表達(dá)的部位主要集中于海馬、邊緣系統(tǒng)等與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的腦區(qū)，然而RAG1是否與學(xué)習(xí)和記憶功能有關(guān)目前尚

3、未明確。
　　大腦和免疫系統(tǒng)都具有編碼記憶的能力，研究資料也表明腦內(nèi)存在著與免疫系統(tǒng)中相類似的基因重組。為了明確腦內(nèi)RAG1基因的缺失是否會影響學(xué)習(xí)記憶功能，通過對RAG1敲除小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，RAG1缺失會引起小鼠神經(jīng)行為的改變。然而，用基因敲除技術(shù)來研究RAG1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的功能存在著不足之處，因?yàn)閯游飶呐咛テ诰烷_始缺失RAG1基因會造成免疫缺陷，對其發(fā)育過程會產(chǎn)生干擾，從而對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果造成影響。
　　因此本工作

4、采用RNA干擾技術(shù)，避開基因敲除技術(shù)的弊端，對杏仁核區(qū)RAG1的表達(dá)進(jìn)行了基因沉默，比較研究RAG1基因沉默前后大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的變化。
　　第一部分、條件性恐懼訓(xùn)練對大鼠杏仁核內(nèi)RAG1表達(dá)的影響
　　目的:
　　檢測條件恐懼訓(xùn)練后大鼠杏仁核區(qū)RAG1的表達(dá)變化。
　　方法與結(jié)果:
　　大鼠隨機(jī)分為對照組和條件性恐懼實(shí)驗(yàn)組，建立條件恐懼記憶模型，并以呆立時(shí)間(freezing time)評價(jià)大鼠對條件恐

5、懼事件的記憶。條件恐懼刺激后30min、1h，應(yīng)用熒光定量PCR對大鼠杏仁核區(qū)RAG1的表達(dá)量進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組大鼠在被重新放入電擊箱后，5min內(nèi)的呆立時(shí)間明顯長于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組杏仁核內(nèi)RAG1的表達(dá)量明顯增加。
　　結(jié)論:
　　條件性恐懼訓(xùn)練會引起大鼠杏仁核區(qū)RAG1表達(dá)水平增高。
　　第二部分、大鼠RAG1基因shRNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定
　　目的:

6、
　　構(gòu)建有效的慢病毒載體，并觀察其對RAG1表達(dá)的抑制效應(yīng)。
　　方法與結(jié)果:
　　設(shè)計(jì)針對RAG1基因的最優(yōu)shRNA序列及1對無關(guān)序列，經(jīng)單鏈片段的合成和退火后，分別克隆至pMagic4.1載體的酶切位點(diǎn)處，經(jīng)酶切、測序鑒定正確后，將重組質(zhì)粒與包膜質(zhì)粒pMD2G、包裝質(zhì)粒pMDlg/pRRE及REV表達(dá)質(zhì)粒pRSV-Rev共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝成慢病毒。Real-time PCR方法測定病毒滴度，感染體外培養(yǎng)的

7、大鼠神經(jīng)元后，通過免疫印跡和Real-time PCR檢測RAG1的表達(dá)水平。測定LV-shRNA病毒的滴度為2.08×108TU/ml，對照病毒(LV-Negative)的滴度為1.79×109TU/ml。與未感染慢病毒組相比較，慢病毒感染神經(jīng)元后，RAG1的表達(dá)水平受到明顯的抑制。
　　結(jié)論:
　　根據(jù)RAG1基因序列利用siRNA target finder軟件設(shè)計(jì)出特異性的shRNA序列。成功構(gòu)建了慢病毒載體，該載體

8、能有效感染大鼠原代神經(jīng)元并抑制RAG1的表達(dá)。
　　第三部分、RNA干擾下調(diào)杏仁核RAG1表達(dá)對大鼠恐懼記憶的影響
　　目的:
　　觀察RAG1被抑制后是否會影響到恐懼記憶能力，以及隨后觀察杏仁核神經(jīng)元是否有相應(yīng)的形態(tài)學(xué)改變。
　　方法與結(jié)果:
　　SD大鼠隨機(jī)分為三組:分別為正常對照組，注射干擾病毒組(LV-shRNA)，注射對照病毒組(LV-Negative)。通過腦立體定位儀將慢病毒載體注射到大鼠雙側(cè)

9、杏仁核。注射病毒一周后利用RT-PCR檢測慢病毒干擾RAG1mRNA表達(dá)的效果，并切片觀察注射區(qū)GFP表達(dá)情況。慢病毒注射入杏仁核后，RT-PCR結(jié)果顯示RAG1mRNA水平明顯受到抑制。注射慢病毒一周后，不同批次大鼠分別進(jìn)行行為學(xué)測試。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)為逃避潛伏期和穿臺次數(shù)，結(jié)果顯示注射干擾病毒組與對照組以及注射對照病毒組相比沒有顯著性差異。利用單次被動回避反應(yīng)測定大鼠的記憶能力，大鼠停留在明室的時(shí)間即反應(yīng)潛時(shí)，越長代表

10、大鼠記憶能力越佳。結(jié)果顯示，在訓(xùn)練階段三組動物的反應(yīng)潛時(shí)沒有顯著性差異，在測試階段，LV-shRNA組的反應(yīng)潛時(shí)與對照組、LV-Negative組相比明顯減少。條件性恐懼結(jié)果顯示，LV-shRNA組的呆立時(shí)間與對照組、LV-Negative組相比明顯減少。各組大鼠在條件性恐懼觀察結(jié)束后立即處死，取杏仁核組織制作電鏡包埋和切片，電鏡觀察結(jié)果顯示LV-shRNA組杏仁核區(qū)單位面積突觸數(shù)目明顯少于正常組大鼠。
　　結(jié)論:
　　慢病