長鏈非編碼RNA UCA1在肝癌中的表達(dá)、功能及其調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位居各大惡性腫瘤的第四位，且近年來呈逐年上升的趨勢;因其惡性程度高、進(jìn)展十分迅速、預(yù)后極差，死亡率已位居各大惡性腫瘤的第二位。有必要積極探索與HCC相關(guān)的基因，為HCC發(fā)病機(jī)制研究以及臨床診療提供新思路和新靶標(biāo)。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)是近年來發(fā)現(xiàn)的與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的一類缺乏

2、蛋白編碼能力的RNA分子。新近研究表明，lncRNAs可作為競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)，通過其微小RNA反應(yīng)元件(miRNA response elements，MREs)競爭結(jié)合miRNAs，抑制miRNAs的功能與活性，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)miRNAs靶基因mRNAs表達(dá)。UCA1(Urothelial carcinoma associated1)是首先在膀胱癌中發(fā)現(xiàn)的一種新的l

3、ncRNA分子，文獻(xiàn)報(bào)道其在膀胱癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等腫瘤中高表達(dá)并與腫瘤惡性進(jìn)展密切相關(guān)。但UCA1在HCC中的表達(dá)模式、功能角色及潛在作用機(jī)制尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。
　　目的：探討UCA1在HCC中的表達(dá)模式及臨床意義;分析RNA干擾UCA1對HCC細(xì)胞增殖、克隆形成、細(xì)胞周期、侵襲與遷移以及裸鼠移植瘤生長的影響;并深入探討基于ceRNA模式的UCA1--miRNA--mRNA--pathway調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

4、
　　方法：(1)lncRNA芯片篩選HCC癌組織中的lncRNA分子;(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)驗(yàn)證篩選的UCA1;(3)Fisher精確概率法、Kaplan-Meier生存曲線以及Cox回歸模型分析UCA1表達(dá)與HCC患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性;(4)構(gòu)建UCA1短發(fā)夾RNA干擾載體，轉(zhuǎn)染高表達(dá)UCA1的HCC細(xì)胞株，檢測干擾效率;(5)CCK-8法檢測

5、細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期、平板法檢測細(xì)胞克隆形成、Transwell小室法檢測細(xì)胞侵襲與遷移以及裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)對UCA1在HCC中的生物學(xué)功能進(jìn)行分析;(6)生物信息學(xué)預(yù)測可與UCA1發(fā)生作用的miRNA，以及相應(yīng)miRNA的靶基因;(7)qRT-PCR及免疫組化分析臨床HCC標(biāo)本中UCA1、miRNA以及靶基因三者表達(dá)之間的相關(guān)性;(8)雙熒光素酶試驗(yàn)及RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNA Binding Protein Immu

6、noprecipitation，RIP）試驗(yàn)驗(yàn)證UCA1可與miRNA作用于RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）;(9)分析UCA1是否可抑制miRNA的生物學(xué)功能;(10)雙熒光素酶試驗(yàn)驗(yàn)證miRNA與靶基因之間的關(guān)系;(11) qRT-PCR與Westem blot分析UCA1、miRNA對其靶基因mRNA及蛋白表達(dá)的影響;(12)Western blot分析與靶基因相關(guān)的信號

7、通路蛋白及其磷酸化蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：(1)通過lncRNA基因芯片檢測并且qRT-PCR證實(shí)，UCA1在HCC癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織，P＜0.001。(2)UCA1與HCC患者TNM分期、是否有遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，P＜0.001;生存曲線顯示高表達(dá)UCA1的HCC患者總生存時(shí)間明顯縮短，P＜0.001;單因素及多因素回歸分析顯示UCA1可用于判斷HCC患者的不良預(yù)后。(3)構(gòu)建兩個(gè)針對UCA1的RNA干擾載體，分別轉(zhuǎn)

8、染高表達(dá)UCA1的HCC細(xì)胞株（SMMC-7721和HepG2細(xì)胞），干擾效率分別為siUCA1＃1:81％和78％; siUCA1#2:54％和47％; siUCA1#1+ siUCA1#2:66％和60％，選用siUCA1#1干擾載體（即siUCA1）進(jìn)行后繼UCA1功能學(xué)研究。(4) siUCA1轉(zhuǎn)染SMMC-7721和HepG2細(xì)胞后，可體外抑制細(xì)胞增殖、克隆形成能力以及侵襲與遷移，并且誘導(dǎo)HCC細(xì)胞周期G0/G1期阻滯;同時(shí)，

9、siUCA1轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞，可體內(nèi)抑制裸鼠移植瘤的生長。(5)生物信息學(xué)預(yù)測UCA1序列中存在可與miR-216b、miR-665、miR-326、miR-212-5p、miR-338-3p、miR-567及miR-136-3p互補(bǔ)結(jié)合的MREs;在siUCA1轉(zhuǎn)染的HCC細(xì)胞中，僅miR-216b表達(dá)明顯升高（＞2倍）;而其余6個(gè)miRNAs的表達(dá)無明顯變化或有輕微變化（＜1.5倍）。(6)構(gòu)建UCA1的熒光素酶報(bào)告載體，與miR-2

10、16b共轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞，雙熒光素酶試驗(yàn)證實(shí)二者可通過MRE互補(bǔ)結(jié)合;RIP試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)UCA1與miR-216b相互作用于RISC。(7)miR-216b在HCC癌組織中表達(dá)與癌旁相比明顯降低，P＜0.01，且HCC癌組織中UCA1與miR-216b的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，r=-0.6224，P＜0.0001。(8)miR-216b可抑制HCC細(xì)胞的增殖與克隆形成、侵襲與轉(zhuǎn)移、裸鼠移植瘤的生長以及誘導(dǎo)細(xì)胞周期G0/G1期阻滯;而UCA1可

11、在體、內(nèi)外逆轉(zhuǎn)miR-216b對HCC細(xì)胞生長與轉(zhuǎn)移的抑制效應(yīng)。(9)生物信息學(xué)預(yù)測成纖維生長因子受體1(fibroblast growth factor receptor1，F(xiàn)GFR1)是miR-216b的靶基因之一。雙熒光素酶試證實(shí)FGFR1是miR-216b的靶基因，miR-216b或siUCA1均可下調(diào)HCC細(xì)胞中FGFR1 mRNA及蛋白的表達(dá);UCA1過表達(dá)可上調(diào)FGFR1 mRNA及蛋白的表達(dá);而當(dāng)miR-216b與UCA

12、1同時(shí)共轉(zhuǎn)染時(shí)可恢復(fù)FGFR1 mRNA及蛋白的表達(dá)。(10)在HCC組織標(biāo)本中，F(xiàn)GFR1蛋白與mRNA的表達(dá)與UCA1的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，r=0.7114與0.6116，P＜0.0001;而與miR-216b的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，r=-0.5040與-0.7094，P＜0.0001。(11)Western blot分析顯示，UCA1不是通過FGFR1-JNK及FGFR1-p38 MAPK信號通路，而是通過FGFR1-ERK1/2信號通

13、路來促進(jìn)HCC惡性進(jìn)展。
　　結(jié)論：UCA1在HCC中高表達(dá)，且與TNM分期、轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后相關(guān)。UCA1可作為一個(gè)癌基因促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖、侵襲與遷移以及裸鼠移植瘤的形成。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)UCA1可作為ceRNA競爭結(jié)合miR-216b，可逆轉(zhuǎn)miR-216b對HCC細(xì)胞的生長及轉(zhuǎn)移的抑制作用，并解除miR-216b對其靶基因FGFR1的抑制，F(xiàn)GFR1表達(dá)增高，且通過ERK信號(UCA1-miR-216b-FGFR1-ERKpat