重組人NT-proBNP雙抗夾心酶聯(lián)免疫方法檢測試劑盒的研發(fā).pdf

1、隨著基因工程技術的成熟，運用基因工程方法制備重組蛋白代替天然提取物并篩選抗體以滿足免疫學體外診斷原料需求，在診斷試劑領域得到了大力推廣[1];大部分重組蛋白具有與天然蛋白性質相同的氨基酸組成及一級結構、相似的抗原表位及活性中心，故可作為天然活性蛋白的替代品進行免疫獲得特異性抗體。
　　 B型腦鈉肽(BNP)具有控制水鹽平衡、維持壓力恒定、調節(jié)機體穩(wěn)態(tài)的作用，主要受到壓力和容量兩種因素調節(jié)，進而能預示出心室容積擴大、左室舒張末期壓

2、增大，心室超負荷以及心臟損傷程度等一系列心血管異常情況。氨基末端B型腦鈉肽前體(N-terminal fragment of brain natriuretic peptideprohormone，NT-proBNP)是B型腦鈉肽前體(proBNP)形成BNP過程中產生的附屬產物，從生物學意義方面分析，是一種無活性蛋白，因與BNP等摩爾數(shù)生成，故NT-proBNP與BNP同樣可以作為一種心臟標志物[2]。由于NT-proBNP缺乏主動清

3、除機制，在體液中的半衰期要長，濃度更大，更容易檢測，并且檢測樣本更容易獲得，因此其已經(jīng)成為一種主要的心臟檢測指標，自問世起則被稱為“劃時代的心衰標志物”。NT-proBNP檢測試劑盒的研發(fā)不僅具有很高的科研價值、經(jīng)濟價值、還能推進診斷試劑國產化進程、打破國外壟斷現(xiàn)象。
　　 重組NT-proBNP蛋白采用大腸桿菌表達系統(tǒng)，優(yōu)選大腸桿菌偏好密碼子，選擇融合蛋白標簽重組表達增加蛋白穩(wěn)定性，發(fā)酵條件優(yōu)化后得到了較高的表達量[3]。兩步

4、親和層析純化目的蛋白，采用腸激酶酶切，將標簽蛋白與目的蛋白分離并進行純化，經(jīng)過SDS-PAGE及羅氏全自動生化分析儀檢測顯示，純度達到95％以上，具有較高的生物學活性。
　　 經(jīng)檢測成功的重組蛋白具有天然蛋白相同的氨基酸序列及生物學活性，可用于免疫，制備單克隆抗體，經(jīng)過免疫、融合、檢測、篩選、克隆化、定株等過程，共獲得47株單克隆抗體，其中包含兩兩配對抗體8株，配對抗體靈敏度均小于4ng(p≤0.05)，親和力達到106以上(p