類風(fēng)濕因子檢測試劑盒的研發(fā).pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種常見的風(fēng)濕性疾病,患病率約為0.4％-1.0%,該病如不能及時診斷和治療,常在起病后1-3年出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形,嚴(yán)重影響日常工作和生活,提高其早期診斷率是醫(yī)務(wù)工作者所關(guān)注的問題。類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor,RF)是診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的重要標(biāo)準(zhǔn)之一,快速高效準(zhǔn)確地檢測RF對RA的診斷及預(yù)后具有非常重要的意義。目前RF的檢測方法有:膠乳凝集法、ELISA(e

2、nzyme linked immunosorbent assay)法和免疫比濁法(透射比濁法,散射比濁法,膠乳增強(qiáng)比濁法)。膠乳凝集法是較早的測定RF的方法,但僅能對RF進(jìn)行半定量測定,且只能測定IgM-RF。后兩種方法可對RF進(jìn)行定量測定,ELISA法可測定RF及其亞型。目前,隨著全自動生化分析儀的普及,散射比濁法和透射比濁法是近年來使用較多的RF測定方法,在這兩種檢測方法的基礎(chǔ)上又建立了靈敏度更高乳膠增強(qiáng)比濁法,但目前的檢測試劑為國

3、外進(jìn)口,費(fèi)用昂貴,開發(fā)低價質(zhì)優(yōu)的國產(chǎn)RF檢測試劑盒對于減輕患者負(fù)擔(dān)具有重要的意義。本課題的旨在根據(jù)膠乳比濁法的基本原理,開發(fā)具有自我知識產(chǎn)權(quán)國產(chǎn)RF定量檢測試劑盒,為臨床診斷提供價格低廉、臨床診斷價值高的試劑。將大小均一粒徑為100nm的聚苯乙烯膠乳顆粒進(jìn)行透析處理,制備工作微球。應(yīng)用硫酸銨沉淀及親和層析的方法,從健康人血清中提取純化人免疫球蛋白IgG,并將提取的IgG交聯(lián)到工作微球上,得到免疫微球。以不同濃度的PEG6000為加速劑,

4、觀察免疫微球與RF的凝聚情況。選擇PEG6000的最適濃度、RF最佳反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、加樣量、檢測波長,并繪制RF標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定RF檢測的線性范圍。通過重復(fù)性實驗測定批間批內(nèi)變異系數(shù),回收實驗確定系統(tǒng)誤差,確定正常人群RF參考值范圍。測定通過金標(biāo)準(zhǔn)確認(rèn)RA患者血清RF,計算敏感性、特異性。實驗結(jié)果表明膠乳比濁法RF定量檢測的最佳反應(yīng)條件為:PEG的最佳濃度為3.8%,膠乳的最佳濃度為0.30%,加樣量為10μL,檢測波長500nm,反

5、應(yīng)時間共15分鐘。批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為1.80～4.33%和7.53～14.14%;RF檢測試劑的評價結(jié)果為:檢測敏感度為81.5%,特異性為69.0%,躍頓指數(shù)50.5%;樣品中加入已知量RF測定,回收率為94.2～106.5%,對含高濃度RF的血清樣品稀釋測定,結(jié)果表明方法的健全性良好。最低測定靈敏度為3IU/ml。穩(wěn)定實驗試劑保質(zhì)期為12月以上(4℃)。成功地制備了膠乳比濁法RF定量檢測試劑盒,為臨床實驗室RF的檢測提供了新的