犬鉤蟲daf和mex-3同源基因的克隆表達(dá).pdf

1、鉤蟲(hoookworm)是鉤口科線蟲的統(tǒng)稱,是重要的人獸共患寄生蟲。成蟲寄生于腸道吸食血液,破壞粘膜,嚴(yán)重寄生會造成嚴(yán)重貧血,是世界范圍內(nèi)缺鐵性貧血的主因,兒童感染鉤蟲后會造成發(fā)育遲緩。
　　為了解犬鉤蟲中DAF-12、DAF-19、DAF-21,mex-3的功能,我們對犬鉤蟲的daf_12B、daf-19,daf-21基因進(jìn)行了克隆并和mex-3基因一起進(jìn)行表達(dá)鑒定。獲得的cDNA片段大小分別為571bp(daf-12B)、5

2、70bp(daf-19)、468bp(daf-21)。將測序正確的片段構(gòu)建到原核表達(dá)載體上,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),通過SDS-PAGE分析表達(dá)情況。
　　分析發(fā)現(xiàn)重組蛋白分子量大小分別為36kDa(DAF-12B)、40kDa(DAF-19)、38kDa(DAF-21)和48kDa(MEX-3),進(jìn)行了重組蛋白的純化和免疫獲得相應(yīng)抗體。用Western Blot檢測了這些蛋白在L1/L2、L3、雌

3、蟲中的表達(dá)情況,結(jié)果表明這些蛋白在L1/L2、L3和雌蟲中均有表達(dá)。
　　Real-time PCR的結(jié)果顯示daf-12B的mRNA轉(zhuǎn)錄發(fā)生在犬鉤蟲的L1/L2、L3、雌蟲和雄蟲階段,在成蟲階段表達(dá)較高,其中雄蟲表達(dá)量最高;daf-19的mRNA在L3期表達(dá)量最高;daf-21的mRNA轉(zhuǎn)錄在成蟲階段表達(dá)量非常之高,L3期幼蟲中含量很少,在L1/L2期幼蟲中表達(dá)量最低。用RT-PCR技術(shù)檢測mex-3的mRNA在犬鉤蟲不同階段的

4、轉(zhuǎn)錄情況,在L2期中幾乎未表達(dá),L3期含量也較低,而在成蟲特別是雌蟲中含量很高。
　　利用免疫熒光抗體染色分析了這四種蛋白在犬鉤蟲不同發(fā)育時期的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)這四種基因在犬鉤蟲不同發(fā)育時期均有表達(dá)。DAF-12B在犬鉤蟲L1/L2期中幼蟲頭部,特別是食道球中的熒光強烈,L3期DAF-12B分布在整個蟲體中,成蟲切片免疫熒光定位結(jié)果顯示DAF-12B分布在皮層、卵巢等部位。
　　DAF-19在蟲卵細(xì)胞質(zhì)中有明顯的表達(dá),在L1/

5、L2期腸道處熒光特別強烈,L3期可以觀察到DAF-19在食道腺、腸道細(xì)胞胞質(zhì)熒光較亮,尾部有特異性熒光表達(dá)。DAF-19在鉤蟲體腔壁、腸壁有特異性的分布,在卵巢、卵壁以及卵內(nèi)都有分布。
　　DAF-21在蟲卵中有明顯表達(dá)。在L1/L2期,我們發(fā)現(xiàn)表皮處熒光特別強烈,L3期可以觀察到DAF-21分布在蟲體前部食道腺、腸道。DAF-21在鉤蟲體腔壁、腸壁有特異性的分布。
　　MEX-3在蟲卵細(xì)胞質(zhì)中有明顯的表達(dá),熒光強烈.在L1