惡性瘧原蟲abstrakt同源基因的克隆及食蟹猴瘧原蟲eIF-4A同源蛋白的cDNA克隆、表達和ATP酶活性研究.pdf

1、DEAD-box蛋白家族的ATP依賴的RNA解旋酶類參與細胞內幾乎所有的RNA代謝過程，在幾乎所有生物的細胞生長發(fā)育過程中扮演著眾多不可或缺的角色。瘧疾目前仍然是世界上許多地方的一個主要的健康問題；控制瘧疾的一個可行的辦法就是研制出通過阻斷瘧原蟲生長有關的關鍵酶來抑制其生長的藥物，比如通過阻斷DNA/RNA解旋酶等。按照此思路，我們進行了有關瘧原蟲DNA/RNA解旋酶的研究。本研究主要開展了兩個方面的工作：1.克隆了Plasmodium

2、flaciparumabstrakt全長基因，分析了該蛋白的結構；并且依據(jù)不同DEAD-box蛋白的結構特征進行了初步歸類。2.克隆了Plasmodium.cynomolgieIF-4A完整cDNA，表達了該重組蛋白并對其ATPase活性進行了檢測。 在本實驗中，通過PCR和探針雜交相結合的篩選方法，篩選惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)的基因組文庫，克隆了FH1F—abstrakt同源基因的完整序列。通過搜

3、索已經完成測序的惡性瘧原蟲基因組數(shù)據(jù)庫，推測FH1F序列定位在第5條連鎖群上。FH1F全長2804bp，包含一個1161bp的完整閱讀框，編碼一個由386個氨基酸組成的蛋白。對FH1F蛋白序列用BiastP進行搜索和分析以及用DNAStar與許多典型的DEAD-box蛋白序列進行比對分析，結果均提示FH1F蛋白應該是DEAD-box家族的一個Abstrakt蛋白。另一方面，用DNAStar對已知所有完整的DEAD-box蛋白進行詳細的序

4、列分析以及用Mega對這些序列進行系統(tǒng)發(fā)育研究的結果都顯示：DEAD-box家族的蛋白聚類成為若干不同的亞家族；與DEAD-box蛋白的一般保守序列相比，Abstrakt，eIF-4A，Vasa，P68等不同亞群的DEAD-box蛋白在保守區(qū)具有各自不同的結構特征。本文對不同的DEAD-box蛋白的結構特征進行了總結并試圖給出不同亞群分類上的結構標準，對Abstrakt蛋白在本應高度保守的位點上異常于其它DEAD-box蛋白的氨基酸殘基

5、的取代也進行了相關的初步分析。 采用同樣的基因克隆方法篩選食蟹猴瘧原蟲(Plasmodiumcynomolgi)的cDNA文庫，克隆了一個eIF-4A同源蛋白的完整cDNA序列，命名為CHlF。CH1F全長1753bp,包含一個1197bp的完整閱讀框，推測編碼一個由398個氨基酸組成的蛋白。對CH1F的蛋白序列用BlastP進行搜索和分析，提示它應該是DEAD-box家族的一個eIF-4A同源蛋白；用DNAStar將其與許多典

6、型的DEAD-box蛋白序列進行比對分析，結果顯示：比起其它的DEAD-box蛋白，它與eIF-4A或eIF-4A的同源蛋白具有更高的一致性和更多序列上的相似結構域。將包含完整閱讀框的片段亞克隆到表達載體pET-28a(+)，在大腸桿菌DH5a中表達，產生的融合蛋白大小在45kD左右。對該融合蛋白進行純化、重新折疊和初步鑒定。ATP酶活性檢測顯示，該融合蛋白只有很低的ATP酶活性，而且它的ATP酶活性似乎不依賴于核酸底物。對這一檢測結果