幽門(mén)螺桿菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)hp0527-C和hp0523基因的功能鑒定與分析.pdf

1、目的:
　　 幽門(mén)螺桿菌(Heliocbacter pylori,H.pylori)的某些毒力因子是通過(guò)Cag致病島(cag pathogenicity island,Cag-PAI)編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)(typeⅣ secretion system,TFSS)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胃粘膜細(xì)胞而發(fā)揮毒性作用。目前已知幽門(mén)螺桿菌的Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白的編碼基因有27種,但多數(shù)基因的功能尚未十分清楚。本文以cagY/hp0527基因和hp0523基因?yàn)?/p>

2、研究對(duì)象,探討它們?cè)冖粜头置谙到y(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)毒力因子過(guò)程中的作用,為進(jìn)一步研究Ⅳ型分泌系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和深入闡明幽門(mén)螺桿菌的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.根據(jù)GenBank收錄的H.pylori22695全基因組序列,利用生物信息學(xué)軟件Primer Primier5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,獲取hp0527-C和hp0523基因,T-A克隆后構(gòu)建pMD18-T-hp0527-C和pGEM-T-hp0523載體,進(jìn)行序列測(cè)定；

3、并對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析研究；
　　 2.構(gòu)建pET-28a-hp0527-C和pET-28a-hp0523原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,SDS-PAGE法和Western blot法鑒定表達(dá)后,并以Ni2+-NTA柱分離純化目的蛋白；進(jìn)一步對(duì)純化蛋白進(jìn)行生物學(xué)活性研究；
　　 3.純化后的HP0527-C融合蛋白免疫家兔,制備抗HP0527-C多克隆抗體,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(e

4、nzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)血清抗體效價(jià)。
　　 4.HP0527-C融合蛋白與BGC-823細(xì)胞作用一定時(shí)間,提取細(xì)胞總RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)IL-8 mRNA的表達(dá)；并用四甲基偶氮唑藍(lán)(㈣檢測(cè)蛋白對(duì)BGC-823細(xì)胞增殖的影響。
　　 5.擴(kuò)增獲得hp0527和hp0523基因上、下游同源臂片段F1、F2,構(gòu)建自殺質(zhì)粒pBlueKM40

5、/△hp0527::Kmr,pBlueKM40/Ahp0523::Kmr,電擊轉(zhuǎn)化H.pylori后經(jīng)抗生素篩選hp0527和hp0523基因缺失株,再進(jìn)行PCR鑒定；
　　 6.采用hp0527和hp0523基因缺失株和野生株與胃癌上皮細(xì)胞BGC-823進(jìn)行共培養(yǎng),而后采用Western blot法檢測(cè)CagA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)能力變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.擴(kuò)增獲得的hp0527-C基因全長(zhǎng)1494bp,編碼498

6、aa,與根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens,A.tumefaciens)的VirB10具有較高的同源性；hp0523基因全長(zhǎng)為510 bp,編碼169 aa,與GenBank公布的26695、J99同源性為92～95％；蛋白相對(duì)分子量Mr預(yù)測(cè)為19.7 kDa,等電點(diǎn)pI為9.53；蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析,在33～165位aa之間存在一個(gè)保守的SLT催化基序,第56位谷氨酸(GLU56)是催化活性的中心位點(diǎn),C端序

7、列上含有一個(gè)肽聚糖結(jié)合域“AVGAY”,故預(yù)測(cè)hp0523基因可能是一個(gè)肽聚糖水解酶編碼基因；
　　 2.構(gòu)建獲得了原核表達(dá)載體pET-28a-hp0527-C和pET-28a-hp0523,IPTG誘導(dǎo)后,經(jīng)SDS-PAGE鑒定和Western blot鑒定有目的蛋白表達(dá)；采用Ni2+-NTA柱梯度洗脫后,分離獲得了目的蛋白HP0527-C和HP0523；HP0527-C融合蛋白免疫家兔,獲得抗HP0527-C多克隆抗體的效價(jià)

8、為1:1.6×104。
　　 3.終濃度10μg·ml-1的HP0527-C融合蛋白作用于胃癌上皮細(xì)胞BGC-823細(xì)胞4h后,可擴(kuò)增出IL-8片段；不同濃度的HP0527-C融合蛋白與BGC-823細(xì)胞作用6、12、24及48h后,細(xì)胞增殖的程度隨著HP0527-C融合蛋白濃度的增高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。
　　 4.HP0523經(jīng)復(fù)性處理后,采用溶菌斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有溶菌活力；而后采用SDS煮沸法分離提取獲得細(xì)菌

9、肽聚糖,進(jìn)行凝膠酶譜分析后,發(fā)現(xiàn)HP0523蛋白具有肽聚糖水解能力；理化特性研究表明,HP0523具有廣譜的溶菌能力,但酶活力較溶菌酶低；其最適酶活力pH值為6.0;
　　 5.連接F1、F2后構(gòu)建自殺質(zhì)粒pBlueKM40/△hp0527::Kmr,pBlueKM40/△hp0523::Kmr電擊轉(zhuǎn)化后經(jīng)抗生素篩選,并經(jīng)PCR驗(yàn)證后獲得了hp0527和hp0523基因缺失株；缺失株、野生株分別與胃癌上皮細(xì)胞BGC-823進(jìn)行共

10、培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)hp0527和hp0523基因缺失株處理組,胃癌上皮細(xì)胞內(nèi)未能檢測(cè)到CagA的轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究成功克隆了hp0527-C基因,是H.pylori cag PAI編碼的TFSS的結(jié)構(gòu)基因之一。構(gòu)建了原核表達(dá)載體,獲得了HP0527-C融合蛋白,其融合蛋白可誘導(dǎo)胃癌上皮細(xì)胞BGC-823細(xì)胞表達(dá)IL-8 mRNA,24h表達(dá)量最高,同時(shí)對(duì)細(xì)胞的增殖有一定抑制作用。
　　 2.本研究結(jié)