幽門螺桿菌Cag致病島中hp0523基因功能的鑒定與分析.pdf

1、目的：幽門螺桿菌的細胞毒性蛋白A(CagA)是一個重要的毒力因子，與胃癌的發(fā)生密切相關。其是通過Cag致病島(Cag—PAI)編碼的Ⅳ型樣分泌裝置，轉運進入胃上皮細胞，發(fā)揮毒性作用。而Cag—PAI中編碼的基因功能及其致病機理均尚未十分明確。研究Cag—PAI中編碼的hp0523基因的功能，并探討其在CagA轉運過程中的作用，為深入研究Cag—PAI的致病機理奠定基礎。 方法：①利用PCR技術從H．pylori基因組DNA中擴增

2、獲取hp0523基因，T—A克隆后構建pGEM—T—hp0523，進行序列測定；并對其序列進行生物信息學分析研究；②構建pET-28a—hp0523原核表達載體，轉化表達宿主菌BL21(DE3)；經(jīng)IFFG誘導后，SDS—PAGE法和Western blot法鑒定表達后，并以Ni2+—NTA柱分離純化目的蛋白；進一步對純化蛋白進行生物學活性研究；③擴增獲得hp0523基因上下游同源臂片段F1、F2，構建自殺質粒pBlueKM40/Δhp

3、0523：Kmr，電擊轉化H．pylori后經(jīng)抗生素篩選hp0523基因缺失株，再進行PCR鑒定；④采用hp0523基因缺失株和野生株與胃癌上皮細胞BGC-823進行共培養(yǎng)，而后采用Western blot法檢測CagA蛋白轉運能力變化。 結果：⑴擴增獲得的hp0523基因全長為510bp，編碼169aa，與GenBank公布的26695、J99同源性為92～95％：蛋白相對分子量Mr預測為19.7 kDa，等電點pI為9.53

4、；蛋白二級結構分析，在33～165位aa之間存在一個保守的SLT催化基序，第56位谷氨酸(GLU56)是催化活性的中心位點，C端序列上含有一個肽聚糖結合域“AVGAY”，故預測hp0523基因可能是一個肽聚糖水解酶編碼基因；⑵構建獲得了原核表達載體pET-28a—hp0523，IPTG誘導后，經(jīng)SDS—PAGE鑒定和Western blot鑒定有目的蛋白表達；采用Ni2+—NTA柱梯度洗脫后，分離獲得了目的蛋白HP0523；⑶HP052

5、3經(jīng)復性處理后，采用溶菌斑點實驗證實其具有溶菌活力：而后采用SDS煮沸法分離提取獲得細菌肽聚糖，進行凝膠酶譜分析后，發(fā)現(xiàn)HP0523蛋白具有肽聚糖水解能力；理化特性研究表明，HP0523具有廣譜的溶菌能力，但酶活力較溶菌酶低；其最適酶活力pH值為6.0；⑷連接F1、F2后構建自殺質粒pBlueKM40/Δhp0523：：Kmr，電擊轉化后經(jīng)抗生素篩選，并經(jīng)PCR驗證后獲得了hp0523基因缺失株；缺失株、野生株分別與胃癌上皮細胞BGC-