腸外致病性大腸桿菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)的功能研究.pdf

1、Ⅵ型分泌系統(tǒng)(TypeⅥsecretionsystem，T6SS)是新近發(fā)現(xiàn)的存在于革蘭氏陰性菌變形菌門部分致病菌中的一種蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)，是這類細(xì)菌的一種重要毒力因子。T6SS是由15～25個(gè)基因編碼的蛋白形成的貫穿細(xì)菌“內(nèi)膜-周質(zhì)空間-外膜”的跨膜復(fù)合結(jié)構(gòu)，其形成的管道能直接穿過靶細(xì)胞的生物膜發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，作用的靶細(xì)胞既可以是原核細(xì)胞，也可以是真核細(xì)胞。溶血素共調(diào)節(jié)蛋白(Hemolysin-CoregulatedProtein，Hc

2、p)是形成T6SS分泌裝置的通道的結(jié)構(gòu)蛋白，同時(shí)也是對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的重要的效應(yīng)蛋白，被認(rèn)為是T6SS的分子標(biāo)志(hallmark)。
　　 腸外致病性大腸桿菌（ExtraintestinalpathogenicEscherichiacoli，ExPEC）是一類重要的人畜共患傳染病病原，能引起人和動(dòng)物腸道以外多種組織器官病變。近年來，許多豬場(chǎng)發(fā)生腦膜炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥等疾病的豬只ExPEC的分離率呈上升趨勢(shì)，這類菌株

3、往往具有較強(qiáng)的耐藥性，給養(yǎng)殖場(chǎng)疾病的防控帶來很大的困難，同時(shí)造成養(yǎng)殖場(chǎng)較大的損失。
　　 本研究在前期對(duì)5株豬源ExPEC進(jìn)行基因組測(cè)序及比較基因組研究的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)ExPEC強(qiáng)致病菌株相比弱致病性菌株，其染色質(zhì)中有完整的T6SS基因簇，其中PCN033菌株具有3個(gè)hcp基因(hcp1-3)。本研究通過基因敲除的方法獲得ExPECT6SS缺失突變菌株，將其與親本菌株比較，研究該系統(tǒng)對(duì)豬源吞噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞的作用，以及分泌蛋白的差

4、異。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　 1.腸外致病性大腸桿菌缺失突變株P(guān)CN033△hcp3的構(gòu)建
　　 參照全基因測(cè)序獲得的豬源ExPECPCN033基因組結(jié)構(gòu)圖設(shè)計(jì)引物，以該菌基因組為模板分別擴(kuò)增hcp3基因上下游片段，串聯(lián)并構(gòu)建重組自殺性質(zhì)粒pRE△hcp3，通過結(jié)合轉(zhuǎn)移將重組質(zhì)粒導(dǎo)入野生菌株P(guān)CN033，利用Cm抗性和蔗糖敏感性篩選接合子。將PCR鑒定正確的接合子在不含NaCl的LB培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，促使第二次同源重組發(fā)

5、生，再篩選出Cm敏感、蔗糖抗性的克隆，PCR鑒定以確定發(fā)生了第二次交換，得到hcp3基因缺失突變株P(guān)CN033△hcp3。
　　 2.腸外致病性大腸桿菌Hcp1多克隆抗體的制備及鑒定
　　 參照基因序列設(shè)計(jì)引物，以該菌基因組為模板擴(kuò)增hcp1基因，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-hcp1，轉(zhuǎn)化入宿主菌大腸桿菌BL21，通過IPTG誘導(dǎo)獲得融合表達(dá)蛋白Hcp-His，利用鎳離子親和層析柱純化蛋白作為免疫原蛋白，免疫2月齡的大

6、耳白兔，14d后第二次免疫，一周后采集少量血清，經(jīng)westernblot鑒定其具有反應(yīng)性與特異性，再收集血清獲得Hcp1多克隆抗體。
　　 3.腸外致病性大腸桿菌分泌蛋白的提取及Hcp1蛋白的鑒定
　　 將活化的ExPEC親本株P(guān)CN033和T6SS缺失突變株P(guān)CN033△hcp3的菌液轉(zhuǎn)接到M9培養(yǎng)基，于37℃振蕩培養(yǎng)24h，獲得的菌液去除菌體沉淀，利用三氯乙酸沉淀法提取這兩株菌菌液上清中的分泌蛋白。以制備的Hcp1多

7、克隆抗體為一抗，通過Westernblot檢測(cè)分泌蛋白中存在Hcp蛋白，證明ExPEC親本菌株P(guān)CN033的T6SS具有活性，同時(shí)通過比較親本株和缺失突變株Hcp蛋白分泌量的差異，發(fā)現(xiàn)hcp3基因的缺失減弱了該菌株Hcp蛋白的分泌。
　　 4.腸外致病性大腸桿菌缺失突變株致病力的研究
　　 將缺失突變株P(guān)CN033△hcp3及其親本株P(guān)CN033以106、107、108三個(gè)梯度的菌量，通過腹腔注射途徑感染BalB/C小鼠

8、，結(jié)果表明，這兩株菌對(duì)小鼠的致死率幾乎沒有差異;按菌落形成單位與細(xì)胞數(shù)10∶1的比值，分別將PCN033△hcp3和PCN033與小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW)在37℃CO2培養(yǎng)箱共孵育，分別在第1h，2h和3h進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)存活菌量的平板計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示兩株菌在RAW內(nèi)的存活菌量的比較在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)都沒有差異;而同樣的方法在豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）中，PCN033和PCN033△hcp3存活菌量存在著較顯著的差異，尤其第3h差異最顯著，分別是35