可注射式組織工程髓核移植治療椎間盤退變的實驗研究.pdf

1、目的: 證實可注射支架材料與種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程髓核能夠修復(fù)椎間盤缺損，阻止椎間盤進(jìn)一步退變，修復(fù)已經(jīng)退變椎間盤，為退變性椎間盤疾病的治療開辟一條新的有效途徑。 方法: 1.種子細(xì)胞培養(yǎng)鑒定及篩選 1.1兔椎間盤髓核細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及鑒定 取健康2周齡新西蘭兔椎間盤髓核細(xì)胞，在含有15％滅活FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察原代和傳代細(xì)胞形態(tài)。分別在取材后、第1代、第2代

2、細(xì)胞培養(yǎng)期間，進(jìn)行髓核細(xì)胞活力測定；爬片培養(yǎng)后進(jìn)行甲苯胺藍(lán)、HE、聚集蛋白聚糖番紅O、I型膠原和II型膠原免疫組織化學(xué)染色，光鏡鏡下觀察；MTT法繪制髓核細(xì)胞生長曲線，并行透射電鏡觀察，對細(xì)胞體外的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。 1.2兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及鑒定 無菌條件下抽取健康幼年新西蘭兔脛骨骨髓2ml，經(jīng)密度梯度離心后獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，接種至100ml玻璃培養(yǎng)瓶中進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察其細(xì)胞形態(tài)、貼壁率和超微結(jié)構(gòu)

3、，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物及細(xì)胞生長周期，并進(jìn)行成骨誘導(dǎo)反向證明，對細(xì)胞體外的生物學(xué)行為進(jìn)行研究。 1.3比較上述兩種細(xì)胞優(yōu)缺點，篩選出最適合的種子細(xì)胞進(jìn)行下一步實驗 2.可注射式組織工程髓核的構(gòu)建及其生物學(xué)功能檢測 種子細(xì)胞與殼聚糖水凝膠復(fù)合形成可注射式組織工程髓核；細(xì)胞計數(shù)檢測細(xì)胞在凝膠中存活情況；組織工程髓核Ⅱ型膠原蛋白及蛋白聚糖免疫組化染色。 3.經(jīng)后路兔椎間盤髓核穿刺抽吸術(shù)建立椎間盤退變模型

4、 模擬人后路顯微內(nèi)窺鏡椎間盤摘除術(shù)，穿刺抽吸髓核，建立椎間盤退變模型。 4.可注射式組織工程髓核移植治療椎間盤退變 可注射式組織工程髓核注射移植入動物退變椎間盤內(nèi)，分別于術(shù)后4周、8周處死實驗動物，對相應(yīng)椎間盤進(jìn)行組織學(xué)及基因表達(dá)情況檢測。 結(jié)果: 1.種子細(xì)胞培養(yǎng)鑒定及篩選 1.1兔髓核細(xì)胞：1、倒置相差顯微鏡觀察見原代髓核細(xì)胞呈類圓形，折光較強，5d始有細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈多角形或短梭形，

5、6～8 d細(xì)胞生長進(jìn)入指數(shù)期，約17 d時，細(xì)胞長滿瓶壁，可進(jìn)行傳代，隨傳代次數(shù)增加，細(xì)胞形態(tài)逐漸由多角形、短梭形向長梭形改變；2、髓核細(xì)胞活力測定表明細(xì)胞在剛分離完成后活力約95％～97％，原代培養(yǎng)期間細(xì)胞活力為98％～100％，第1代培養(yǎng)期間細(xì)胞活力一般仍能維持為100％，第2代細(xì)胞活力下降較為明顯，約為75％～80％；3、髓核細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色呈強陽性，HE染色見細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)著色明顯，原代、第1代髓核細(xì)胞I型膠原蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染

6、色均呈陰性，II型膠原蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陽性，聚集蛋白聚糖番紅O染色呈陽性反應(yīng)，而第2代髓核細(xì)胞I型膠原蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性，II型膠原蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈弱陽性，聚集蛋白多糖番紅O染色著色較淺；4、MTT生長曲線與體外細(xì)胞培養(yǎng)時生長過程相符；5、細(xì)胞透射電鏡顯示原代髓核細(xì)胞內(nèi)線粒體少，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量糖原顆粒，隨傳代次數(shù)增加，糖原顆粒減少，線粒體數(shù)量增多，細(xì)胞器開始腫脹。 1.2兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：1、兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)

7、胞在體外培養(yǎng)2h后開始貼壁，20h后細(xì)胞基本貼壁完全，15d左右細(xì)胞融合達(dá)90％以上；2、透射電鏡觀察顯示分離培養(yǎng)的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞表面可見許多微絨毛，主要分布于胞體一側(cè)，胞核不規(guī)則，有切跡，細(xì)胞器豐富，具有典型未分化細(xì)胞特點；3、流式細(xì)胞儀檢測顯示分離培養(yǎng)的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44、CD90表達(dá)呈陽性，CD45表達(dá)呈陰性，且絕大多數(shù)(約占細(xì)胞總數(shù)的97％)細(xì)胞的生長周期處于G1或G2期；4、成骨性誘導(dǎo)3周后，骨髓間充

8、質(zhì)干細(xì)胞逐漸形成小的鈣鹽結(jié)晶體，細(xì)胞堿性磷酸酶染色呈陽性，Von Kossa染色顯示細(xì)胞聚集處存在大量鈣鹽，呈黑色沉積。 1.3篩選結(jié)果：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞較髓核細(xì)胞取材方便，體外培養(yǎng)擴(kuò)增容易，適合作為組織工程髓核的種子細(xì)胞。 2.可注射式組織工程髓核的構(gòu)建及生物學(xué)功能檢測 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以在殼聚糖水凝膠中生長增殖，并向類髓核細(xì)胞分化，II型膠原蛋白及蛋白聚糖免疫組化染色陽性。 3.經(jīng)后路兔椎間盤髓核穿

9、刺抽吸術(shù)建立椎間盤退變模型 3.1退變椎間盤HE染色觀察 退變4周的椎間盤可見髓核內(nèi)出現(xiàn)多個裂隙，髓核內(nèi)細(xì)胞顯示軟骨細(xì)胞化生，髓核與內(nèi)層纖維環(huán)交界處細(xì)胞可見核代償性增大，纖維環(huán)內(nèi)層纖維中度扭曲和裂隙形成，伴有內(nèi)層纖維環(huán)輕度向椎間盤凸入，按Nishimura標(biāo)準(zhǔn)分級為2-3級。退變8周后見髓核細(xì)胞基本消失，部分中央髓核區(qū)域缺如，可見較多形態(tài)類似成纖維細(xì)胞的細(xì)胞，纖維環(huán)纖維重度向椎間盤內(nèi)凸入，呈指狀突起，伸展至髓核內(nèi)部，甚至

10、髓核與內(nèi)層纖維環(huán)結(jié)構(gòu)不清，按Nishimura標(biāo)準(zhǔn)分級為4-5級。 3.2退變椎間盤Ⅱ型膠原蛋白免疫組化染色 退變組4周染色見整個椎間盤呈現(xiàn)出淡黃色樣，髓核中央深黃褐色陽性反應(yīng)不明顯，整個椎間盤結(jié)構(gòu)不清，退變組8周后再次行Ⅱ型膠原蛋白免疫組化見中央髓核區(qū)域陽性反應(yīng)不明顯，結(jié)構(gòu)紊亂。 4.可注射式組織工程髓核移植治療椎間盤退變 4.1正常對照組及移植組椎間盤HE染色顯示椎間盤結(jié)構(gòu)清晰，髓核組織及外周纖維環(huán)分

11、界清晰，細(xì)胞核及細(xì)胞漿染色明顯，缺損退變組顯示椎間盤結(jié)構(gòu)紊亂，髓核組織和外周纖維環(huán)分界不清； 4.2Aggrecan番紅O染色提示正常對照組及移植組椎間盤染色明顯，椎間盤結(jié)構(gòu)清晰，缺損退變組顯示椎間盤結(jié)構(gòu)紊亂，髓核組織和外周纖維化分界不清； 4.3Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色：正常對照組以中央髓核組織染色為主，呈黃褐色陽性反應(yīng)，整個椎間盤結(jié)構(gòu)清晰，移植治療組中央髓核組織呈陽性反應(yīng)，細(xì)胞間質(zhì)中可見明顯黃褐色，大體結(jié)構(gòu)仍保持完整

12、，缺損退變組染色較前兩組淺，且結(jié)構(gòu)不清； 4.4椎間盤Ⅱ型膠原蛋白、蛋白聚糖RT-PCR檢測結(jié)果顯示正常組椎間盤組織與移植治療組的椎間盤組織在Aggrecan和II-collagen基因表達(dá)上無明顯差異(p>0.05)，同時發(fā)現(xiàn)缺損退變組Aggrecan和II-collagen的表達(dá)明顯下調(diào)，并與正常組及移植治療組有明顯差異(p<0.05)。 結(jié)論: 1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源廣泛，取材簡單且具有向類髓核細(xì)胞分化的