組織工程化同種異體椎間盤移植的體外及動物實驗研究.pdf

1、椎間盤退行性疾病是臨床常見病,多發(fā)病,嚴重影響患者日常工作及生活。傳統(tǒng)治療手段存在諸多不足之處,同種異體椎間盤移植有望克服傳統(tǒng)治療方式的缺陷。但臨床研究證實異體間盤移植后出現(xiàn)了不同程度的退行性改變,這將限制椎間盤移植的遠期臨床效果。如能通過合適的技術(shù)手段將這一擁有巨大臨床應用潛力的治療措施予以完善,將會為椎間盤退變性疾病的治療提供全新的治療選擇。
　　本研究中,借鑒組織工程的理念來審視同種異體椎間盤移植,我們將同種異體間盤視作椎間

2、盤組織工程的天然支架材料,并以組織工程的技術(shù)手段來優(yōu)化同種異體椎間盤的生物活性。通過復合具有生物活性的種子細胞使之組織工程化。在體外成功構(gòu)建組織工程化異體間盤的基礎(chǔ)上,擬通過大量動物實驗驗證細胞干預技術(shù)是否可有效延緩同種異體椎間盤移植后的退行性改變。
　　1.組織工程化同種異體椎間盤的構(gòu)建及體外觀察
　　目的:觀察rAAV2-hTERT病毒載體轉(zhuǎn)染對犬髓核細胞生活學活性的影響;探討以rAAV2-hTERT-NPc體外組織工程

3、化同種異體椎間盤的可行性。
　　方法:rAAV2-hTERT病毒載體以1×105v.g/cell的MOI轉(zhuǎn)染犬髓核細胞。在轉(zhuǎn)染后5d、10d、15d、30d及60d分別以RT-PCR、Westernbloting方法檢測髓核細胞中hTERT mRNA及蛋白的表達;利用real-time PCR、Elisa法分別檢測髓核細胞蛋白多糖、Ⅰ和Ⅱ膠原 mRNA及蛋白表達量。以上檢測均與以rAAV2-EGFP轉(zhuǎn)染的髓核細胞(對照組)進行對比

4、。30個冷凍保存椎間盤隨機分為3組, A組注入5×106cell/ml hTERT-NPc細胞懸液25ul作為實驗組;B組注入5×106cell/ml EGFP-NPc細胞懸液25ul作為陰性對照組;C組不做處理作為空白對照。將構(gòu)建完成的細胞-同種異體椎間盤支架復合體置于50ml離心管中常規(guī)條件下培養(yǎng)。在體外培養(yǎng)的第10、20及30天, DMMB法檢測組織工程化椎間盤內(nèi)蛋白多糖表達量并進行3組間比較。
　　結(jié)果:rAAV2可成功轉(zhuǎn)

5、染犬髓核細胞,在轉(zhuǎn)染后5d,10d,15d,30d以及60d,均可于基因和蛋白水平檢測到hTERT基因在髓核細胞內(nèi)的表達,而在所有觀察時間點內(nèi),對照組未能檢測到hTERT基因表達。在轉(zhuǎn)染后第10天hTERT基因表達的相對水平最高,而隨著細胞傳代次數(shù)的增加,hTERT基因表達也逐漸降低;RT-PCR顯示在轉(zhuǎn)染后的第十天至第六十天,實驗組PG、COLⅡmRNA的表達量明顯高于對照組細胞的mRNA表達,其高峰出現(xiàn)于轉(zhuǎn)染后的第15天,PG、CO

6、LⅡmRNA的表達量分別較對照組增加了132％和87%,實驗組與對照組在COLⅠmRNA表達上無明顯差別; ELISA檢測蛋白多糖及Ⅱ型膠原表達量提示:在轉(zhuǎn)染后的第十天,實驗組 PG、COLⅡ的表達量顯著增加,在轉(zhuǎn)染后的第十天至第六十天,實驗組髓核細胞 PG、COLⅡ的表達量均明顯高于對照組。組織工程化同種異體椎間盤體外培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn),椎間盤大體形態(tài)及結(jié)構(gòu)保持完好,30天時可于A組椎間盤內(nèi)部發(fā)現(xiàn)PKH-26紅色熒光細胞,B組可觀察到EGF

7、P綠色熒光細胞的存在。DMMB法分析髓核組織中蛋白多糖的結(jié)果顯示:3組髓核組織中的蛋白多糖含量均呈上升趨勢。其中,A、B兩組升高幅度明顯大于C組,至第三十天時,A組PG含量明顯高于兩對照組,且B組較C組PG明顯高表達(P<0.05)。
　　結(jié)論:使用rAAV2-hTERT病毒轉(zhuǎn)染可成功實現(xiàn)體外培養(yǎng)條件下髓核細胞增殖能力及細胞外基質(zhì)表達的上調(diào),外源性種子細胞體外培養(yǎng)條件下可于椎間盤內(nèi)部存活30天以上并促進髓核內(nèi)蛋白多糖的表達,通過細

8、胞干預技術(shù)可以實現(xiàn)同種異體椎間盤的功能優(yōu)化,有可能實現(xiàn)同種異體椎間盤移植遠期療效的提高。
　　2.組織工程化同種異體椎間盤移植的動物實驗研究
　　目的:通過比格犬體內(nèi)原位植入實驗探討同種異體椎間盤移植的轉(zhuǎn)歸并觀察種子細胞的介入能否延緩移植后椎間盤的退行性改變。
　　方法:12月齡beagle犬18只隨機分為3組,分別植入hTERT-NPc組織工程化的同種異體椎間盤(Group A);NPc組織工程化的同種異體椎間盤(G

9、roup B)以及未組織工程化的同種異體椎間盤(Group C)。每只實驗動物于術(shù)后即刻及4、8、12weeks行X線片正側(cè)位及MRI檢查,觀察各組移植椎間盤的轉(zhuǎn)歸并測量各椎間盤高度及 MRI T2相髓核信號比灰度值進行比較;手術(shù)后3m麻醉狀態(tài)下處死實驗動物取L1-L7段脊柱標本進行屈伸、旋轉(zhuǎn)及左右側(cè)彎6個方向的穩(wěn)定性分析比較;完成生物力學分析的腰椎標本,每組各取1個間盤,RT-PCR法檢測椎間盤組織中的hTERT mRNA的表達;將剩

10、余標本切片后行激光共聚焦顯微鏡觀察PKH-26標記細胞;HE染色觀察移植間盤組織學改變。
　　結(jié)果:通過腰椎側(cè)前方入路可成功完成同種異體椎間盤植入手術(shù)操作,部分實驗動物出現(xiàn)切口疝、一過性下肢神經(jīng)功能障礙、移植物脫落及化膿性感染等并發(fā)癥。X線及MRI檢查結(jié)果顯示除發(fā)生脫落并發(fā)癥的兩只間盤外,其余移植間盤與宿主椎體均實現(xiàn)了良好的骨性融合。其中C組間盤術(shù)后出現(xiàn)了呈進展趨勢的退行性改變,至移植后12周,其椎間盤高度及髓核信號比灰度值明顯低

11、于A/B兩組(P<0.05),而A/B兩組退行性改變相對較輕,未見明顯進展趨勢;生物力學顯示術(shù)后12周時,C組移植間盤出現(xiàn)了明顯穩(wěn)定性喪失;術(shù)后12周的RT-PCR分析于A組髓核內(nèi)檢測到hTERT mRNA的陽性表達;術(shù)后12周可通過激光共聚焦顯微鏡觀察于實驗組髓核區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)紅色熒光細胞;組織學觀察發(fā)現(xiàn) A、B兩組移植間盤結(jié)構(gòu)保持較好,外形類似軟骨細胞的髓核細胞數(shù)量較多,排列較為規(guī)則;而C組髓核形態(tài)保持欠佳,結(jié)構(gòu)較為紊亂,髓核細胞數(shù)量明