組織工程化同種異體椎間盤移植的體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、椎間盤退行性疾病是臨床常見病,多發(fā)病,嚴(yán)重影響患者日常工作及生活。傳統(tǒng)治療手段存在諸多不足之處,同種異體椎間盤移植有望克服傳統(tǒng)治療方式的缺陷。但臨床研究證實(shí)異體間盤移植后出現(xiàn)了不同程度的退行性改變,這將限制椎間盤移植的遠(yuǎn)期臨床效果。如能通過(guò)合適的技術(shù)手段將這一擁有巨大臨床應(yīng)用潛力的治療措施予以完善,將會(huì)為椎間盤退變性疾病的治療提供全新的治療選擇。
　　本研究中,借鑒組織工程的理念來(lái)審視同種異體椎間盤移植,我們將同種異體間盤視作椎間

2、盤組織工程的天然支架材料,并以組織工程的技術(shù)手段來(lái)優(yōu)化同種異體椎間盤的生物活性。通過(guò)復(fù)合具有生物活性的種子細(xì)胞使之組織工程化。在體外成功構(gòu)建組織工程化異體間盤的基礎(chǔ)上,擬通過(guò)大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞干預(yù)技術(shù)是否可有效延緩?fù)N異體椎間盤移植后的退行性改變。
　　1.組織工程化同種異體椎間盤的構(gòu)建及體外觀察
　　目的:觀察rAAV2-hTERT病毒載體轉(zhuǎn)染對(duì)犬髓核細(xì)胞生活學(xué)活性的影響;探討以rAAV2-hTERT-NPc體外組織工程

3、化同種異體椎間盤的可行性。
　　方法:rAAV2-hTERT病毒載體以1×105v.g/cell的MOI轉(zhuǎn)染犬髓核細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后5d、10d、15d、30d及60d分別以RT-PCR、Westernbloting方法檢測(cè)髓核細(xì)胞中hTERT mRNA及蛋白的表達(dá);利用real-time PCR、Elisa法分別檢測(cè)髓核細(xì)胞蛋白多糖、Ⅰ和Ⅱ膠原 mRNA及蛋白表達(dá)量。以上檢測(cè)均與以rAAV2-EGFP轉(zhuǎn)染的髓核細(xì)胞(對(duì)照組)進(jìn)行對(duì)比

4、。30個(gè)冷凍保存椎間盤隨機(jī)分為3組, A組注入5×106cell/ml hTERT-NPc細(xì)胞懸液25ul作為實(shí)驗(yàn)組;B組注入5×106cell/ml EGFP-NPc細(xì)胞懸液25ul作為陰性對(duì)照組;C組不做處理作為空白對(duì)照。將構(gòu)建完成的細(xì)胞-同種異體椎間盤支架復(fù)合體置于50ml離心管中常規(guī)條件下培養(yǎng)。在體外培養(yǎng)的第10、20及30天, DMMB法檢測(cè)組織工程化椎間盤內(nèi)蛋白多糖表達(dá)量并進(jìn)行3組間比較。
　　結(jié)果:rAAV2可成功轉(zhuǎn)

5、染犬髓核細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染后5d,10d,15d,30d以及60d,均可于基因和蛋白水平檢測(cè)到hTERT基因在髓核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),而在所有觀察時(shí)間點(diǎn)內(nèi),對(duì)照組未能檢測(cè)到hTERT基因表達(dá)。在轉(zhuǎn)染后第10天hTERT基因表達(dá)的相對(duì)水平最高,而隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加,hTERT基因表達(dá)也逐漸降低;RT-PCR顯示在轉(zhuǎn)染后的第十天至第六十天,實(shí)驗(yàn)組PG、COLⅡmRNA的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組細(xì)胞的mRNA表達(dá),其高峰出現(xiàn)于轉(zhuǎn)染后的第15天,PG、CO

6、LⅡmRNA的表達(dá)量分別較對(duì)照組增加了132％和87%,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在COLⅠmRNA表達(dá)上無(wú)明顯差別; ELISA檢測(cè)蛋白多糖及Ⅱ型膠原表達(dá)量提示:在轉(zhuǎn)染后的第十天,實(shí)驗(yàn)組 PG、COLⅡ的表達(dá)量顯著增加,在轉(zhuǎn)染后的第十天至第六十天,實(shí)驗(yàn)組髓核細(xì)胞 PG、COLⅡ的表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組。組織工程化同種異體椎間盤體外培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn),椎間盤大體形態(tài)及結(jié)構(gòu)保持完好,30天時(shí)可于A組椎間盤內(nèi)部發(fā)現(xiàn)PKH-26紅色熒光細(xì)胞,B組可觀察到EGF

7、P綠色熒光細(xì)胞的存在。DMMB法分析髓核組織中蛋白多糖的結(jié)果顯示:3組髓核組織中的蛋白多糖含量均呈上升趨勢(shì)。其中,A、B兩組升高幅度明顯大于C組,至第三十天時(shí),A組PG含量明顯高于兩對(duì)照組,且B組較C組PG明顯高表達(dá)(P<0.05)。
　　結(jié)論:使用rAAV2-hTERT病毒轉(zhuǎn)染可成功實(shí)現(xiàn)體外培養(yǎng)條件下髓核細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的上調(diào),外源性種子細(xì)胞體外培養(yǎng)條件下可于椎間盤內(nèi)部存活30天以上并促進(jìn)髓核內(nèi)蛋白多糖的表達(dá),通過(guò)細(xì)

8、胞干預(yù)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)同種異體椎間盤的功能優(yōu)化,有可能實(shí)現(xiàn)同種異體椎間盤移植遠(yuǎn)期療效的提高。
　　2.組織工程化同種異體椎間盤移植的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:通過(guò)比格犬體內(nèi)原位植入實(shí)驗(yàn)探討同種異體椎間盤移植的轉(zhuǎn)歸并觀察種子細(xì)胞的介入能否延緩移植后椎間盤的退行性改變。
　　方法:12月齡beagle犬18只隨機(jī)分為3組,分別植入hTERT-NPc組織工程化的同種異體椎間盤(Group A);NPc組織工程化的同種異體椎間盤(G

9、roup B)以及未組織工程化的同種異體椎間盤(Group C)。每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于術(shù)后即刻及4、8、12weeks行X線片正側(cè)位及MRI檢查,觀察各組移植椎間盤的轉(zhuǎn)歸并測(cè)量各椎間盤高度及 MRI T2相髓核信號(hào)比灰度值進(jìn)行比較;手術(shù)后3m麻醉狀態(tài)下處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取L1-L7段脊柱標(biāo)本進(jìn)行屈伸、旋轉(zhuǎn)及左右側(cè)彎6個(gè)方向的穩(wěn)定性分析比較;完成生物力學(xué)分析的腰椎標(biāo)本,每組各取1個(gè)間盤,RT-PCR法檢測(cè)椎間盤組織中的hTERT mRNA的表達(dá);將剩

10、余標(biāo)本切片后行激光共聚焦顯微鏡觀察PKH-26標(biāo)記細(xì)胞;HE染色觀察移植間盤組織學(xué)改變。
　　結(jié)果:通過(guò)腰椎側(cè)前方入路可成功完成同種異體椎間盤植入手術(shù)操作,部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)切口疝、一過(guò)性下肢神經(jīng)功能障礙、移植物脫落及化膿性感染等并發(fā)癥。X線及MRI檢查結(jié)果顯示除發(fā)生脫落并發(fā)癥的兩只間盤外,其余移植間盤與宿主椎體均實(shí)現(xiàn)了良好的骨性融合。其中C組間盤術(shù)后出現(xiàn)了呈進(jìn)展趨勢(shì)的退行性改變,至移植后12周,其椎間盤高度及髓核信號(hào)比灰度值明顯低

11、于A/B兩組(P<0.05),而A/B兩組退行性改變相對(duì)較輕,未見明顯進(jìn)展趨勢(shì);生物力學(xué)顯示術(shù)后12周時(shí),C組移植間盤出現(xiàn)了明顯穩(wěn)定性喪失;術(shù)后12周的RT-PCR分析于A組髓核內(nèi)檢測(cè)到hTERT mRNA的陽(yáng)性表達(dá);術(shù)后12周可通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察于實(shí)驗(yàn)組髓核區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)紅色熒光細(xì)胞;組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn) A、B兩組移植間盤結(jié)構(gòu)保持較好,外形類似軟骨細(xì)胞的髓核細(xì)胞數(shù)量較多,排列較為規(guī)則;而C組髓核形態(tài)保持欠佳,結(jié)構(gòu)較為紊亂,髓核細(xì)胞數(shù)量明