丹參酮ⅡA對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響及其可能分子機(jī)制研究.pdf

1、為了進(jìn)一步研究其可能的生物學(xué)作用和作用機(jī)制，分別用體內(nèi)試驗(yàn)(采用ApoE-/-小鼠模型)和體外試驗(yàn)(采用巨噬泡沫細(xì)胞模型)，研究其可能的分子機(jī)制并進(jìn)一步明確丹參酮Ⅱ A抗As可能的作用靶點(diǎn)。 研究方法： 一．丹參酮ⅡA對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響 1.動(dòng)物的分組和處理 采用經(jīng)典的ApoE-/-。小鼠模型，將其隨機(jī)分為七組，分別為正常組(C57BL/6J)，模型組(ApoE-/-)，模型+丹參酮ⅡA高劑量組(Ap

2、oE-/-+TS(90mg/kg))，模型+丹參酮Ⅱ A中劑量組(ApoE-/-+TS(30 mg/kg))，模型+丹參酮Ⅱ A低劑量組(ApoE-/-+TS(10 mg/kg))，模型+辛伐他丁(ApoE-/-+Sim(10mg/kg))，模型+維生素E(ApoE-/-+VE(100 mg/kg))，藥物用羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)作溶劑，所有組別皆給予正常飼料。動(dòng)態(tài)檢測(cè)血脂水平并動(dòng)態(tài)觀察動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成程度，直至26周。

3、 2.丹參酮Ⅱ A對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響 ①丹參酮Ⅱ A對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積的影響 將小鼠的主動(dòng)脈分離取出，然后取其主動(dòng)脈弓，縱向剖開(kāi)作油紅O染色，做成病理切片后用熒光顯微鏡(sony-DXC960MD)觀察拍照，運(yùn)用IPWIN60進(jìn)行分析。 ②丹參酮ⅡA對(duì)血清中血脂水平和肝臟中血脂水平的影響 血清中總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)的檢測(cè)使用常規(guī)的酶法試劑盒(北京中生北控)。肝臟中TC和TG的檢

4、測(cè)采用100mg/ml在蒸餾水中勻漿，后采用氯仿甲醇(2/1，v/v)萃取，提取的脂質(zhì)用液氮吹干后用異丙醇重新溶解，通過(guò)試劑盒檢測(cè)起血脂的濃度。 ③丹參酮ⅡA對(duì)血清中oxLDL的影響 采用ELISA法檢測(cè)血清中的oxLDL的含量。嚴(yán)格按照試劑盒所附說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。在包被好抗兔oxLDL，抗體的96孔板中加入50ul的標(biāo)準(zhǔn)，蒸餾水，和樣本，然后加入生物素結(jié)合的反應(yīng)液50ul，將其置于37℃孵育60min。孵育結(jié)束后，將反應(yīng)

5、液倒出，然后用在洗板機(jī)上用專用的洗滌液洗5次，將未結(jié)合的從孔內(nèi)洗去，然后將50u1的酶結(jié)合反應(yīng)液加入孔內(nèi)將其置于37℃孵育30min，再一次在洗板機(jī)上用洗滌液洗5次，然后分別加入50ul的顯色劑A和顯色劑B置于37℃孵育15min，最后加入終止液終止反應(yīng)，置于酶標(biāo)儀上在450nm處檢測(cè)吸光度值(OD)。同時(shí)依據(jù)一個(gè)劑量依賴的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以最終得出樣品血清中oxLDL的濃度。 ④丹參酮ⅡA對(duì)血清中SOD和MDA的影響 分別采

6、用常規(guī)的試劑盒檢測(cè)血清中SOD活性和MDA含量。各組血清的SOD活性和MDA含量檢測(cè)的具體方法嚴(yán)格按照試劑盒所附說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在檢測(cè)之前摸索一個(gè)最佳的反應(yīng)體積，經(jīng)摸索血清SOD的最佳上樣量為2ul。 ⑤丹參酮Ⅱ A對(duì)膽固醇攝取相關(guān)基因(CD36,SR-A)表達(dá)的影響 提取小鼠胸腹主動(dòng)脈中的RNA,采用半定量RT-PCR的方法檢測(cè)膽固醇攝取相關(guān)基因表達(dá)的情況。 ⑥丹參酮Ⅱ A對(duì)PPAR-γ表達(dá)的影響 提取小鼠

7、胸腹主動(dòng)脈中的RNA,采用半定量的RT-PCR的方法檢測(cè)PPAR-γ表達(dá)的情況。 二．丹參酮ⅡA對(duì)巨噬細(xì)胞攝取膽固醇的影響 1.巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)與巨噬泡沫細(xì)胞模型的建立 2.丹參酮Ⅱ A對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇攝取的影響 3.丹參酮ⅡA對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇攝取相關(guān)基因以及對(duì)PPAR~表達(dá)的影響。 研究結(jié)果： 一．丹參酮ⅡA對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響 1.與正常對(duì)照組相比，26W后各組ApoE-/-小鼠

8、在體重和一般特征上沒(méi)有顯著性差異 2.與正常對(duì)照組相比，26W后模型組ApoE-/-鼠斑塊面積有明顯的顯著性差異，而與模型組ApoE-/-小鼠相比，丹參酮ⅡA對(duì)ApoE-/-小鼠斑塊面積具有明顯的改善作用，且隨著劑量的增加具有明顯的劑量依賴性，同時(shí)使用的兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照藥亦具有很好的改善斑塊形成的作用。 3.與正常對(duì)照組相比，26W后模型組ApoE-/-小鼠胸腹主動(dòng)脈血脂水平明顯升高，與正常對(duì)照組相比有顯著性差異，而與模型組

9、ApoE-/-小鼠相比，丹參酮ⅡA應(yīng)用組ApoE-/-小鼠胸腹主動(dòng)脈血脂具有明顯的下降，且具有劑量依賴性。同時(shí)使用的兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照藥亦具有很好的降低胸腹主動(dòng)脈血脂的作用，且丹參酮Ⅱ A高劑量組的作用與其作用基本相似。 4.與正常對(duì)照組相比，26W后模型組ApoE-/-小鼠血清中TC和TG水平明顯升高，但應(yīng)用丹參酮Ⅱ A對(duì)血清中血脂沒(méi)有影響，VE組亦沒(méi)有影響，辛伐他丁組卻能很好的顯示其降血脂的作用 5.與正常對(duì)照組相比，26

10、W后模型組．ApoE-/-小鼠肝臟中TC和TG水平明顯升高，但應(yīng)用丹參酮ⅡA組對(duì)肝臟中血脂沒(méi)有影響，VE組亦沒(méi)有影響，辛伐他丁組卻能很好的顯示其降血脂的作用 6.與正常對(duì)照組相比，26W后模型組ApoE-/-小鼠血清中oxlLDL含量明顯升高，而與模型組ApoE-/-小鼠相比，丹參酮Ⅱ A應(yīng)用組ApoE-/-小鼠血清oxLDL水平具有明顯的下降，且具有明顯的劑量依賴性，陽(yáng)性對(duì)照藥物辛伐他丁和VE組亦具有降低血清中oxLDL的作用

11、 7.與正常對(duì)照組相比，26W后模型組ApoE-/-小鼠血清中SOD水平明顯下降，而與模型組ApoE-/-小鼠相比，丹參酮IIA應(yīng)用組ApoE-/-小鼠血清中SOD明顯升高，且具有劑量依賴性，陽(yáng)性對(duì)照藥物辛伐他丁和VE組亦有升高血清中SOD的作用。與正常對(duì)照組相比，26W后模型組ApoE-/-小鼠血清中MDA水平明顯升高，而與模型組ApoE-/-小鼠相比，丹參酮IIA應(yīng)用組ApoE-/-小鼠血清中MDA水平明顯下降，且具有劑量依

12、賴性，同時(shí)陽(yáng)性對(duì)照藥物辛伐他丁和VE組亦有降低血清中MDA的作用． 8.與正常對(duì)照組相比，26W后模型組ApoE-/-小鼠胸腹主動(dòng)脈膽固醇攝取相關(guān)基因CD36和SR-A具有顯著的上調(diào)，而與模型組ApoE-/-小鼠相比，丹參酮ⅡA應(yīng)用組對(duì)膽固醇攝取相關(guān)基因具有劑量依賴性的顯著從下調(diào)作用，而陽(yáng)性對(duì)照藥物辛伐他丁和VE組雖亦有下調(diào)作用，但其作用相對(duì)丹參酮Ⅱ A而言比較的微弱。 二．丹參酮ⅡA對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇攝取的影響

13、1.丹參酮ⅡA抑制巨噬細(xì)胞對(duì)膽固醇的攝取 與正常對(duì)照組相比，將O．1 μ M，1 μ M，10 μ M丹參酮Ⅱ A分別與巨噬細(xì)胞預(yù)孵育24h,用MTT。法來(lái)評(píng)價(jià)丹參酮Ⅱ A對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.1 μM．1 μ M．10 μ M丹參酮Ⅱ A作用細(xì)胞后，吸光度值沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)所用的丹參酮ⅡA濃度對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性和增殖沒(méi)有明顯的影響。 與正常對(duì)照組相比，將0.1 μ M，1 μ M，10 μ M丹參酮ⅡA分

14、別與巨噬細(xì)胞預(yù)孵育2h，再與50 μ g/ml的oxLDL作用24h，酶法檢測(cè)細(xì)胞總膽固醇和游離膽固醇的含量，對(duì)細(xì)胞總膽固醇和游離膽固醇的含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，丹參酮Ⅱ A能夠很好的抑制巨噬細(xì)胞對(duì)膽固醇的攝取，且具有劑量依賴性，其最大的抑制率可以達(dá)到40％左右。 與正常對(duì)照組相比，將0.1 μ M，1 μ M，10 μ M丹參酮Ⅱ A分別與巨噬細(xì)胞預(yù)孵育2h，再與DiI標(biāo)記的oxLDL作用4h,熒光顯微鏡下定性觀察丹參酮Ⅱ A對(duì)巨噬細(xì)胞

15、膽固醇攝取的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹參酮Ⅱ A能夠很好的抑制巨噬細(xì)胞對(duì)膽固醇的攝取，且具有劑量依賴性。 2.丹參酮Ⅱ A對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇攝取相關(guān)基因以及基因PPAR-γ表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組相比，模型組(oxLDL)膽固醇攝取相關(guān)基因CD36和SR-A以及PPAR-γ顯著上調(diào)，而丹參酮Ⅱ A組能夠顯著下調(diào)CD36和PPAR-γ的表達(dá)，但對(duì)SR-A的表達(dá)卻無(wú)明顯的影響。免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA組能夠在蛋白水平上顯著的下調(diào)C

16、D36的表達(dá)。 小結(jié)： 1.丹參酮Ⅱ A能夠顯著改善動(dòng)脈粥樣硬化的形成與發(fā)展，這一作用具有明顯的劑量．效應(yīng)關(guān)系 2.丹參酮Ⅱ A改善動(dòng)脈粥樣硬化的形成不是通過(guò)影響血脂的水平，可能是通過(guò)以下機(jī)制共同作用實(shí)現(xiàn)：通過(guò)抗氧化作用降低血清中oxLDL的水平，改善血清中SOD和MDA的水平；抑制主動(dòng)脈中膽固醇攝取相關(guān)基因CD36和SR-A而抑制泡沫細(xì)胞的形成，而對(duì)CD36的下調(diào)可能是通過(guò)下調(diào)PPAR-γ實(shí)現(xiàn)。 3.丹