玉米黑粉菌CYP51的克隆表達及同殺菌劑分子結(jié)合光譜分析.pdf

1、甾醇14α-去甲基化酶(也稱P45014-DM，CYP51)是唯一的廣泛存在于細菌、真菌、植物和動物中的細胞色素P450家族成員。它被視為最古老的細胞色素P450家族成員。它催化甾醇的14α-去甲基化反應。甾醇14α-去甲基化酶是真菌麥角甾醇合成過程的關鍵酶。抑制真菌甾醇14α-去甲基化酶將會阻礙真菌麥角甾醇的合成。麥角甾醇的缺失會損害細胞膜結(jié)構和功能，最終導致真菌死亡。目前農(nóng)業(yè)上14α-去甲基化酶抑制劑(14α-demethylati

2、oninhibitors，DMIs)類殺菌劑即是通過抑制真菌甾醇14α-去甲基化酶而發(fā)揮殺菌抑菌的作用。
　　 本研究首先從玉米黑粉菌中克隆CYP51基因，并構建了重組表達質(zhì)粒pET-YH、pGEXKG-YH，采用不同的IPTG誘導濃度，不同的誘導溫度，不同的表達宿主菌表達，經(jīng)SDS-PAGE分析玉米黑粉菌CYP51基因均沒有得到有效的表達。通過對其氨基酸序列進行跨膜結(jié)構預測，結(jié)合SYBYL7.0同源模建分析結(jié)果，從而重新克隆了

3、2個玉米黑粉菌CYP51基因，即N端截短了的突變體（分別截短20和35個氨基酸），并構建了重組表達質(zhì)粒(pETYH-20,pETYH-35，pGEXKGYH-20,pGEXKGYH-35)，最終pETYH-35重組表達質(zhì)粒在E.coliBL21(DE3)中得到了大量表達，但是N端截短了20個氨基酸的突變體仍未能有效表達。
　　 將得到的重組玉米黑粉菌CYP51蛋白初步純化后測定蛋白質(zhì)含量，并根據(jù)P450-CO差光譜的方法測定其活

4、性及P450含量，得到其蛋白質(zhì)含量2.92mg/mL，P450含量為3.763pmol/mg。重組玉米黑粉菌CYP51蛋白同四種標準殺菌劑和十種人工合成的三唑類XF系列新型小分子殺菌劑進行了結(jié)合光譜測定研究，根據(jù)重組CYP51和殺菌劑之間的結(jié)合光譜分型并采用米氏方程Hanes-Woolf作圖法計算結(jié)合常數(shù)，得到初步結(jié)論：標準殺菌劑和XF系列殺菌劑相比，結(jié)合常數(shù)均較小，標準殺菌劑中三唑醇的結(jié)合常數(shù)最小，結(jié)合常數(shù)為0.057；XF系列殺菌劑

5、中XF-113結(jié)合常數(shù)最小，結(jié)合常數(shù)為0.307。通過重組玉米黑粉菌CYP51蛋白和殺菌劑之間的結(jié)合常數(shù)，參考生物活性測定結(jié)果對殺菌劑殺菌效果進行初步的評估，并由此推斷真菌CYP51同三唑類殺菌劑的分子構型之間的聯(lián)系。通過生物信息學的手段對得到的結(jié)果進行統(tǒng)計分析以便為設計開發(fā)新型的具有更強結(jié)合作用和更高選擇性DMIs類殺菌劑提供了理論依據(jù)和實驗指導。本研究同時構建了重組真核酵母表達質(zhì)粒pAUR123-YH，采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化后篩選陽性轉(zhuǎn)化子