柑桔綠霉菌CYP51克隆表達(dá)及在DMIs類殺真菌劑篩選中的應(yīng)用.pdf

1、柑桔青霉病(Penicillium italicum Wehmer)和綠霉病(Penicillium digitatum Sacc)是柑桔果實(shí)在貯運(yùn)期發(fā)生最嚴(yán)重的病害。目前農(nóng)業(yè)上廣泛使用的甾醇生物合成抑制劑(sterol biosynthesis inhibitors，SBIs)類殺菌劑主要為14a-脫甲基酶抑制劑(14a—demethylation inhibitors，DMIs)。羊毛甾醇14a-去甲基化酶(CYP51，P45014

2、DM)是唯一廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物中的細(xì)胞色素P450家族成員，它被視為最古老的細(xì)胞色素P450家族成員，是氮唑類抗真菌藥物作用靶標(biāo)酶。CYP5l是真菌細(xì)胞膜麥角甾醇生物合成過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，它催化甾醇的14a-去甲基化反應(yīng)。抑制真菌甾醇14a-去甲基化酶將會(huì)阻礙真菌麥角甾醇的合成，而麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜基本成份，它的缺乏將導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)的破壞和功能消失，最終導(dǎo)致真菌死亡。目前農(nóng)業(yè)上DMIs類殺菌劑即是通過抑制真菌甾醇14a-去

3、甲基化酶而發(fā)揮殺菌抑菌的作用。 本研究以我國(guó)南方重要經(jīng)濟(jì)作物柑桔的病原菌綠霉菌(P．digitamm Sacc)為實(shí)驗(yàn)材料，采用基因工程技術(shù)克隆了柑桔綠霉菌CYP5I基因，進(jìn)行了高效表達(dá)和功能研究。同時(shí)，建立了柑桔綠霉菌CYP5l蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)模型，并利用結(jié)合光譜法對(duì)有機(jī)小分子化合物的活性進(jìn)行了篩選。本文主要得到以下結(jié)果： 1.從柑桔綠霉菌(P．digitatum Sacc)中克隆了氮唑類殺真菌劑的靶標(biāo)酶CYP51(

4、PdCYP51)。該基因與文獻(xiàn)中報(bào)道的柑桔綠霉菌CYP51基因(No．AB030178)相比有四個(gè)核苷酸不同，分別為C1370→T，A1604→G，G1648→A和G1768→T，該基因序列已提交Genbank(登記號(hào)為DQ355161)。這四個(gè)不同的核苷酸相應(yīng)地導(dǎo)致四個(gè)氨基酸的不同，分別是P345→L，EA23→G，G438→R和V478→L。該基因編碼的蛋白質(zhì)由516個(gè)氨基酸組成，同源比對(duì)結(jié)果表明，該蛋白與柑桔綠霉菌PD5(BAB0

5、3658，Pd2)同源性為99％，與意大利青霉P450-14DM(Q12664，Pi)蛋白同源性為86％，與煙曲霉Aspergillus fumigatus(AAF32372，Af)和費(fèi)希新薩托菌Neosartorya fischeri(XP_001267338，Nf)同源性為67％，含有CYP51家族蛋白的特征保守域SRSl(YxxF/LxxPxFGxxVxF/YD/a)和SRS4(GQ/Hht/sS)及P450家族保守域HBR(Fx

6、xGxxxCxG)。序列分析表明四個(gè)突變氨基酸位于PdCYP5l的保守結(jié)構(gòu)域之外，生測(cè)結(jié)果表明這四個(gè)突變氨基酸與該菌的抗性相關(guān)性不大。 2.以結(jié)核分枝桿菌CYP51(Mycobacterium tuberculosis，MTCYP51)晶體結(jié)構(gòu)為模板，利用SYBYL7.0軟件包中的FUGUE模塊成功地構(gòu)建了柑桔綠霉菌CYP51蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)模型，PdCYP5l蛋白三維空間模型與MTCYP51蛋白晶體結(jié)合疊合結(jié)果顯示PdCYP

7、51血紅素輔基附近氨基酸具有很好重疊性。CYP51是一類跨膜蛋白，在真菌的麥角甾醇生物合成過程中起著非常重要的作的用。對(duì)其跨膜區(qū)分析表明，PdCYP51 N端66個(gè)氨基酸跨膜兩次。 構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-PdCYP51并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，37℃下1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，得到了59kDa的特異性蛋白。超聲破碎實(shí)驗(yàn)表明該重組蛋白主要以包涵體形式存在。重組蛋白經(jīng)純化濃縮后，注射家兔制得多克隆抗體。Western blot證明成功地制

8、備了多克隆抗體，與表達(dá)的目的蛋白有特異性單一雜交帶。優(yōu)化pET-PdCYP51表達(dá)條件發(fā)現(xiàn)：在Rosetta(DE3)菌株中，30℃經(jīng)1mM IPTG誘導(dǎo)獲得了可溶性重組蛋白。根據(jù)柑桔綠霉菌CYP51跨膜結(jié)構(gòu)的分析和三維空間結(jié)構(gòu)的分析，重新構(gòu)建了下列突變體，分別命名為。pET-PdCYP51-18、pET-PdCYP51-66、pET-PdCYP51-244和p6P-PdCYP51-244，并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)。對(duì)pET-PdCYP

9、51-18表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，使其蛋白以可溶形式表達(dá)。同時(shí)構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pAUR-PdCYP51、p9K-PdCYP51和p9K-PdCYP51-244。 3.根據(jù)CO差光譜法測(cè)定在Rosetta(DE3)中表達(dá)的PdCYP51重組蛋白活性。以柑桔綠霉菌微粒體和Rosettaq(DE3)中表達(dá)的PdCYP5l重組蛋白為材料，分析了商品化的烯唑醇、戊唑醇、三唑醇和三唑酮為代表的DMIs類殺真菌劑與CYP51的結(jié)合能力，分析

10、了靶標(biāo)酶活性、靶標(biāo)酶純度和靶標(biāo)酶濃度對(duì)二者結(jié)合光譜的影響。結(jié)果表明，靶標(biāo)酶活性和濃度是獲得準(zhǔn)確結(jié)合光譜的必要條件。根據(jù)米氏方程計(jì)算結(jié)合常數(shù)，計(jì)算得到烯唑醇、戊唑醇、三唑醇、三唑酮與靶標(biāo)酶結(jié)合常數(shù)(Kd)，分別為0.12μM、0.32μM、0.64μM和0.99μM。該結(jié)果與其對(duì)柑桔綠霉菌生長(zhǎng)抑制率EC50顯著相關(guān)，證明結(jié)合光譜與生物活性測(cè)定相結(jié)合的方法可作為一種簡(jiǎn)便可靠的DMIs類殺真菌劑篩選方法。 4.利用建立的結(jié)合光譜法對(duì)合

11、成的不同結(jié)構(gòu)類型的化合物(XF系列、WJ系列和ZST系列)進(jìn)行了結(jié)合光譜測(cè)定，結(jié)合生物測(cè)定的結(jié)果篩選出了一批結(jié)合能力強(qiáng)和殺菌效果好的新型抗真菌化合物。這些化合物均為含氮化合物，并且在直鏈的不同位置、咪唑環(huán)或三唑環(huán)上以鹵素原子來取代。在XF系列化合物中，XF-22、XF50、XF-78、XF-100、XF-113、XF118和XF169與PdCYP51和PdCYP51-18的結(jié)合能力較強(qiáng)，同時(shí)生物活性測(cè)定效果較好。在WJ系列的化合物中，W

12、J7、WJlO、WJ11、WJ12、WJ15、WJ21、WJ22、WJ25和WJ26與PdCYP51的結(jié)合能力較強(qiáng)，結(jié)合常數(shù)均小于0.2μM；對(duì)柑桔綠霉菌的抑制率均為100％，有些化合物甚至在25mg/ml的濃度時(shí)其抑菌率仍在80％以上。ZST系列中的ZST1、ZST5和ZST9與PdCYP51的結(jié)合能力較強(qiáng)，抑制率與結(jié)合常數(shù)一致。 5.利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)手段(采用FLexX軟件)將含氮的新型有機(jī)化合物與PdCYP51的活性中心