非標記型電化學適配體傳感器的構建及其在蛋白質檢測中的應用.pdf

1、蛋白質是生命的重要組成物質之一，也是整個生命活動的主要參與者。因此，蛋白質的檢測特別是疾病狀態(tài)下蛋白表達水平的檢測將有助于我們更深入的了解生命的活動過程，對人類疾病的預防、診斷和治療具有重要的現(xiàn)實意義。生物傳感器是以生物分子作為識別元件(RecognitionElement)的檢測方法，因其具有高特異性、高靈敏度和操作便捷等特點成為目前最具有前景的蛋白質檢測方法?？贵w是目前應用最為廣泛的生物分子識別元件，但是因其制備周期長、易失活、對檢

2、測環(huán)境要求較高等缺點，限制了其在生物傳感器中的進一步發(fā)展。近年來越來越多的新型識別元素正在被引入到生物傳感器的制備中，其中核酸適配體就是最為引人矚目的一員。適配體是利用SELEX體外篩選技術從龐大的核酸分子文庫中篩選獲得的單鏈DNA或RNA，它們除了具有類似抗體的高親和性結合與高特異性識別特性外，還表現(xiàn)出許多優(yōu)于抗體的特性如分子量小、靶分子廣泛、易于重復合成、易于標記、保存穩(wěn)定且可以變性復性等，因此適配體正逐漸成為是一種新的理想的生物傳

3、感器識別元件。電化學生物傳感器是一類通過生物分子識別元件將待測物質的濃度轉變?yōu)榭蓹z測的電信號的檢測傳感器，其具有高靈敏度、不受溶液顏色影響，響應速度快、操作便捷、價格低廉、易于微型化等優(yōu)點，將其與核酸適配體相結合，將成為繼免疫電化學傳感器和DNA電化學傳感器后新的研究熱點。
　　本課題的研究目的是建立一種高靈敏度、高特異性、操作便捷的蛋白質電化學適配體生物傳感器。方式是將體外篩選得到的高特異性核酸適配體作為電化學生物傳感器的分子識

4、別元件，通過基于酶信號放大的設計策略，建立能夠非標記地檢測蛋白質的具有高靈敏度、高特異性的新型電化學適配體傳感器，并將其應用于血小板生長因子及蛇毒種類鑒別檢測的研究中。論文內(nèi)容包括以下幾部分:
　　第一章引言簡要的介紹了核酸適配體的篩選原理、優(yōu)越性及利用核酸適配體作為識別元件的方法學研究進展;詳細的介紹了電化學傳感器的原理及應用，以及基于酶信號放大的電化學適配體傳感器的研究進展;著重論述了非標記電化學適配體傳感器的設計策略和研究進

5、展，并同時介紹了蛋白質檢測的意義及方法學現(xiàn)狀。
　　第二章基于酶放大設計策略的非標記電化學適配體傳感器的構建近年來，許多氧化還原酶類的直接電子傳遞(DET)得到了較多的重視和應用。然而，由于固載基質的不穩(wěn)定以及酶活性中心深埋在分子內(nèi)，如果將酶分子直接固定到固體電極上，其DET是很難實現(xiàn)的。為了克服這一缺陷，有不少工作提出將酶固定于納米材料修飾的電極表面，通過納米材料的優(yōu)點來實現(xiàn)酶的DET。其中，石墨烯(Gra)作為一種理想的材料，

6、由于其優(yōu)異的物理化學性能，如大的比表面積、好的導電性和易于功能化等，已經(jīng)得到廣泛的應用。另一方面，納米金(GNPs)具有良好的生物相容性、強吸附能力和好的導電性，也被看作一種優(yōu)良的納米材料。這些性能也就使得PDDA保護的石墨烯-納米金(P-Gra-GNPs)復合物成為更優(yōu)異的固載基質，它不僅能加快活性中心與電極之間的DET，更為酶的固定提供了一個良好的微環(huán)境。由此本研究在二甲基二烯丙基氯化銨均聚物(PDDA)存在下，采用肼將氧化石墨烯還

7、原，得到PDDA保護的還原石墨烯(P-Gra)。P-Gra表面帶正電，通過靜電吸附大量的納米金(AuNPs)，制得納米金功能化的石墨烯復合物(P-Gra-AuNPs)。利用酶的催化特性來放大識別過程中產(chǎn)生的電化學信號。基于此，我們利用葡萄糖氧化酶(GOD)的直接電子傳遞(DET)首次構建了一種新型無試劑無媒介的電化學適體傳感器，并用于對血小板源性生長因子(PDGF)的檢測。
　　第三章基于電化學適配體傳感器的血小板源性生長因子的檢

8、測血小板源性生長因子(Plateletderivedgrowthfactor，PDGF)是一種低分子量促細胞分裂的肽類調(diào)節(jié)因子，因正常生理狀態(tài)下存在于血小板的α顆粒內(nèi)而得名，當血液凝固時由破裂的血小板釋放出來并且被激活，具有刺激停滯于G0/G1期的成纖維細胞、神經(jīng)膠質細胞、平滑肌細胞等進入分裂增殖周期的功能。血小板源性生長因子的檢測在纖維化及癌癥等疾病的診斷、預后評估中具有重要的臨床意義。
　　我們利用血小板源性生長因子適配體構建

9、了基于酶放大的電化學核酸適配體傳感器，經(jīng)過對電化學傳感器修飾電極的表征，可以看到傳感器的氧化還原峰電流減小值與待測PDGF濃度成正比。該適體傳感器顯示出良好的電化學響應，峰電流的減小值與濃度對數(shù)的增加值在0.005-60nM的范圍內(nèi)呈良好的線性，檢測限為1.7pM。該傳感器同樣具有高的選擇性，好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，也為其他基于適配體的蛋白檢測提供了可行的依據(jù)。
　　第四章蛇毒種屬特異性核酸適配體的篩選蛇傷的鑒別診斷需要準確的檢測蛇毒

10、的類型，目前蛇傷的實驗室診斷主要依賴以蛇毒抗體的免疫學診斷方法，但是蛇毒抗體目前存在特異性差、毒性強依靠免疫動物制備困難等缺陷。受核酸適配體篩選原理(SELEX)中反篩原理的啟發(fā)，我們通過在適配體經(jīng)典篩選流程中引入多個鑒別靶標的反篩流程，來獲取與目標靶標更高特異性結合的種屬特異性適配體，我們將該技術稱之為消減指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(Depletesystematicevolutionofligandsbyexponentialenri

11、chment，Deplete-SELEX)。我們在蛇毒種屬特異性適配體篩選中引入了該方法，利用該技術篩選出用于鑒別中華眼鏡蛇毒與國內(nèi)常見的三種種毒蛇（尖吻蝮蛇、江浙蝮蛇、烙鐵頭）的中華眼鏡蛇毒種屬特異性核酸適配體，以利用于后續(xù)建立基于電化學適配體生物傳感器的蛇傷現(xiàn)場快速檢測方法的研究。
　　第五章基于電化學適配體傳感器的蛇毒快速檢測方法的研究目前蛇傷的診斷主要依靠臨床癥狀（如傷口、局部體征等）、常規(guī)化驗（血紅蛋白、尿膽紅素等）或捕

12、獲的蛇來確診，但由于蛇傷早期臨床癥狀往往不明顯、不典型，且大多數(shù)的蛇傷發(fā)生在晚間或山林草地中很難看清蛇種，導致野外條件下蛇傷不能得到及時準確的診斷，無法正確指導抗蛇毒血清的使用以至延誤搶救治療良機。多年來，也有研究者應用免疫電泳、酶聯(lián)免疫以及放射免疫等方法檢測病人標本中各種毒蛇的種屬特異性蛇毒成分，進行蛇傷免疫學鑒別診斷方法的研究，但這些方法的敏感度不夠理想，陽性檢出率受檢材的種類、取材的時間、方法、診斷抗體的質量等因素影響較大。電化學

13、適配體生物傳感器因其檢測速度快，靈敏度高，特異性強，簡單便攜成為蛇毒診斷與現(xiàn)場快速檢測的理想檢測手段。我們利用篩選得到的蛇毒種屬特異性核酸適配體與電化學生物傳感器相結合，構建了用于檢測毒素的電化學適配體生物傳感器，結果顯示該傳感器在毒素種屬的鑒別檢測中具有很好的特異性與靈敏度，可能成為蛇傷檢測中的重要檢測手段。
　　綜上所述，我們采用GOD的直接電化學方法，成功構建了一個基于核酸適配體的高靈敏和高選擇性的非標記電化學適配體傳感器，

14、用于對血小板生長因子及蛇毒特異性蛋白的檢測研究。該傳感器主要有以下優(yōu)點:首先，P-Gra-GNPs復合物膜具有比表面積大和優(yōu)良的生物相容性，它不僅能增加GOD的固載量，還能保持生物分子的活性，提高傳感器的穩(wěn)定性。其次，GNCs膜為PBA的固定提供了一個穩(wěn)定和多孔的表面，進一步增強電化學信號。另外，雙層GOD膜作為示蹤劑帶來更高的電流響應和高的靈敏度?；谝陨系脑?，該傳感器顯示出較低的檢測限，滿意的選擇性，良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。并且該方