核酸適配體在熒光傳感器中的應(yīng)用.pdf

1、近年來(lái)，在生物、材料和信息科學(xué)的發(fā)展成果的推動(dòng)下，生物傳感器的技術(shù)得以飛速發(fā)展，并發(fā)展成為一門(mén)由多門(mén)學(xué)科交叉的新興學(xué)科。其中，利用熒光信號(hào)作為檢測(cè)手段的是熒光生物傳感器，有著發(fā)射波長(zhǎng)的移動(dòng)、熒光的淬滅或者增強(qiáng)。同時(shí)，熒光生物傳感器有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，例如：操作簡(jiǎn)便、選擇性好、靈敏度高、分析速度快等特點(diǎn)，非常有效的推動(dòng)了分析化學(xué)在生物、化學(xué)、食品、環(huán)境、醫(yī)學(xué)、醫(yī)藥等領(lǐng)域中的應(yīng)用?，F(xiàn)在，熒光生物傳感器技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為一種必不可少的先進(jìn)生物技術(shù)

2、，也引起了眾多研究者們的興趣。
　　核酸適配體是一類(lèi)由人工體外合成并篩選出來(lái)的單鏈寡核苷酸，主要通過(guò)體外篩選技術(shù)——指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化法（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選獲得的RNA或DNA片段。篩選出來(lái)的核酸適配體能特異性、高效地結(jié)合目標(biāo)物分子，如金屬離子、蛋白質(zhì)、小分子等。同時(shí)，核酸適配體具有穩(wěn)定性好、生物相容性好、合成容易、

3、易于修飾等諸多的優(yōu)點(diǎn)，使它在構(gòu)建生物傳感器中作為重要的素材得到廣泛的應(yīng)用。近幾年在疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、臨床診斷等許多領(lǐng)域中備受關(guān)注。
　　評(píng)價(jià)一個(gè)傳感器，其性能好壞的主要參數(shù)是選擇性和靈敏度。本研究論文基于核酸適配體和熒光生物傳感器的優(yōu)點(diǎn)即利用熒光生物傳感器來(lái)檢測(cè)溶液的熒光信號(hào)和借助核酸適配體的特異性結(jié)合，分別構(gòu)建一系列新的基于核酸適配體的熒光生物傳感技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)重金屬離子、蛋白質(zhì)、miRNA的高靈敏和高選擇性的檢測(cè)。具體的研究?jī)?nèi)

4、容如下：
　　1.基于目標(biāo)物循環(huán)放大及石墨烯納米材料構(gòu)建高靈敏的熒光檢測(cè)汞離子
　　由于有毒重金屬離子對(duì)環(huán)境和人類(lèi)健康的威脅，因此對(duì)有毒重金屬離子的靈敏監(jiān)測(cè)和選擇性的方法的發(fā)展提出了強(qiáng)烈要求。利用新的核酸外切酶-III（Exo III）輔助目標(biāo)物循環(huán)擴(kuò)增策略和氧化石墨烯（GO）淬滅FAM-ssDNA探針，構(gòu)建了高靈敏的熒光納米傳感器來(lái)檢測(cè)Hg2+。目標(biāo)物Hg2+結(jié)合，并通過(guò)T-Hg2+-T堿基對(duì)折疊吸附在GO上FAM-ssD

5、NA形成雙鏈結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致了FAM-ssDNA從GO的表面上釋放出來(lái)和熒光信號(hào)的恢復(fù)。此外，釋放出折疊的雙鏈可被Exo III剪切并釋放出結(jié)合的Hg2+，釋放出結(jié)合的Hg2+可以與熒光猝滅FAM-ssDNA的納米探針再次關(guān)聯(lián)，并觸發(fā)目標(biāo)物循環(huán)過(guò)程對(duì)GO吸附上FAM-ssDNA的循環(huán)切割。因此，這種目標(biāo)物的回收過(guò)程導(dǎo)致眾多FAM標(biāo)記的堿基釋放回到溶液和獲得用于高靈敏檢測(cè)Hg2+（低至亞-納摩爾級(jí)）的顯著放大熒光信號(hào)。所開(kāi)發(fā)的納米傳感器對(duì)非特定

6、離子也具有高選擇性，有望進(jìn)一步拓展到檢測(cè)其他的超低水平的有毒重金屬離子。
　　2.免標(biāo)記、均相適體鄰位結(jié)合熒光檢測(cè)人血清中標(biāo)志物蛋白質(zhì)
　　本實(shí)驗(yàn)采用適體接近結(jié)合測(cè)定的方法，利用無(wú)標(biāo)記和均相的方法用熒光檢測(cè)人血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB（PDGF-BB）。兩個(gè)連接有G-4序列的適體鏈與PDGF-BB蛋白結(jié)合，導(dǎo)致適體的局部濃度的增加，所以促進(jìn)了G-4分體結(jié)構(gòu)的形成。熒光染料（N-methylmesoporphyrin IX，NM

7、M）與G-4分體結(jié)構(gòu)結(jié)合，產(chǎn)生了靈敏檢測(cè)PDGF-BB的熒光信號(hào)。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳證明了PDGF-BB與適體鏈結(jié)合。在最優(yōu)條件下，PDGF-BB的檢測(cè)限可達(dá)到3.2nmol/L。該實(shí)驗(yàn)方法可用于檢測(cè)稀釋的人血清樣品中的PDGF-BB。利用無(wú)標(biāo)記和均相的優(yōu)點(diǎn)，理論上說(shuō)該方案可用相對(duì)簡(jiǎn)單的方式來(lái)檢測(cè)其他生物標(biāo)志物。
　　3.基于雜交鏈催化組裝的無(wú)酶靈敏檢測(cè)癌癥生物標(biāo)志物mircoRNA
　　鑒別和量化microRNAs（

8、miRNAs）的特異性序列對(duì)不同疾病的早期診斷有重要作用。在本實(shí)驗(yàn)中，我們組合兩個(gè)獨(dú)立的信號(hào)放大的方法——雜交鏈反應(yīng)（HCR）和催化發(fā)夾結(jié)構(gòu)（CHA），無(wú)酶和雙擴(kuò)增的信號(hào)增強(qiáng)策略，高靈敏的檢測(cè)人類(lèi)前列腺癌的生物標(biāo)志物miR-141。在miR-141存在時(shí)，觸發(fā)兩個(gè)發(fā)夾DNA自組裝形成雙鏈DNA的聚合物，通過(guò)共定位使得兩條ssDNA的兩段誘導(dǎo)序列靠近。隨后，這些共定位的ssDNA序列進(jìn)一步充當(dāng)觸發(fā)劑，觸發(fā)兩個(gè)熒光猝滅的發(fā)夾DNA的催化組裝