鼻咽癌放療反應(yīng)預(yù)測的臨床和實驗研究.pdf

1、放射治療是鼻咽癌主要的治療方法。常規(guī)根治性放射治療時，患者雖屬于同一分期，并采用相同的治療技術(shù)、相同的治療劑量，卻有12.1～42.2％患者在5年內(nèi)出現(xiàn)鼻咽局部或區(qū)域淋巴結(jié)復(fù)發(fā)。其原因，主要與腫瘤生物學(xué)特性有關(guān)，其中腫瘤組織對放療的內(nèi)在敏感性存在個體差異是極為重要的原因。同時也可觀察到病況相同的患者在采用相同的治療后可出現(xiàn)不同的放療急性反應(yīng)，遠期并發(fā)癥也有明顯差異，其原因與鼻咽癌患者的正常組織放射敏感性存在個體差異有關(guān)。 在影響

2、腫瘤細胞內(nèi)在放射敏感性的因素中，以凋亡、增殖、腫瘤血管狀況(腫瘤乏氧程度)、DNA或染色體損傷程度等因素與放療反應(yīng)密切相關(guān)。 突變型P53蛋白抑制凋亡，促使增殖。Survivin蛋白抑制caspase 3及caspase7表達，也抑制凋亡發(fā)生。Ki67蛋白是與增殖細胞相關(guān)的核抗原，其陽性率反映腫瘤的增殖活性。VEGF蛋白在低氧的刺激下表達增加，促進血管內(nèi)皮細胞分裂、增殖、微血管生成，局部微血管密度增高。VEGF-C特異性作用于淋

3、巴內(nèi)皮細胞，誘導(dǎo)淋巴管形成，其表達與淋巴管密度一致，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 射線造成靶細胞染色體損傷程度與其放射敏感性一致，松胞素阻滯微核法(cvtokinesis-block micronucleus assay，CBMNA)是檢測靶細胞受射線照射或化學(xué)物損傷后第一次核分裂時染色體損傷的程度，有靈敏度極高，操作簡便、快速、成功率高、設(shè)備要求低，同時可觀察細胞形態(tài)，可獲取多種信息等優(yōu)點，松胞素阻滯微核法檢測外周血淋巴細胞及體外

4、培養(yǎng)的腫瘤細胞，已成功用于正常組織輻射損傷、腫瘤組織放療反應(yīng)等檢測。 本研究主要包括以下三方面：(1)對影響放療反應(yīng)關(guān)系密切的凋亡、增殖、血管生成狀況(間接反映腫瘤組織乏氧程度)、淋巴管生成狀況等方面的生物分子指標進行篩選，期待找出有價值的預(yù)測指標；(2)用CBMNA檢測已知放射敏感性差異的鼻咽高分化鱗癌細胞株CNE1及低分化鱗癌細胞株CNE2，觀察微核率及微核細胞率差異，了解該方法在鼻咽癌細胞株檢測上的可行性；(3)用外周血淋

5、巴細胞CBMNA等前瞻性研究微核率及微核細胞率與放射治療急性反應(yīng)、50Gy鼻咽腫瘤消退率、放療后3個月腫瘤射野內(nèi)局控狀況等關(guān)系，探討外周血淋巴細胞CBMNA微核率、微核細胞率等預(yù)測鼻咽癌正常組織急性反應(yīng)、腫瘤近期局控狀況可行性。 [材料與方法] 1.用免疫組化S-P法檢測鼻咽癌單純根治性外照射后5年射野內(nèi)復(fù)發(fā)組60例與隨機選取的同期射野內(nèi)局控組60例鼻咽腫瘤組織中P53、Survivin、Ki67、VEGF、VEGF-C

6、蛋白表達及微血管密度(microvascular density,MVD)計數(shù)，分析上述指標在局控組與復(fù)發(fā)組間差異，及其相互關(guān)系。 2.對鼻咽癌細胞株CNE1、CNE2分別用克隆形成法檢測照射劑量0、0.5、1、2、4、6、8Gy的存活分數(shù)(survival fraction，SF)、用松胞素阻滯微核法檢測照射劑量0、0.5、1、2、4、6、8Gy的微核率(micronucleus frequency，MNF)、微核細胞率(mi

7、cronucleated cells frequency，MNCF)等，分析SF、MNF、MNCF在不同劑量下CNE1、CNE2間的統(tǒng)計學(xué)差異；用線性二次模型擬合生存曲線，比較CNE1、CNE2間α值、α/β值、SF2觀察值與擬合值間差異；用線性模型擬合MNF、MNCF與劑量間關(guān)系；用相關(guān)分析、曲線擬合分析CNE1、CNE2的SF與MNF、MNCF間關(guān)系，以明確兩種檢測方法結(jié)果是否一致。 3.對42例常規(guī)根治性放療的鼻咽癌病人前

8、瞻性臨床試驗：(1)放療前、放療20Gy、60Gy時抽取外周血，放療前血標本分裝成5份在X線機下照射0、0.5、1、2、4Gy，放療20Gy、60Gy時的外周血直接培養(yǎng)，行松胞素阻滯微核法檢測微核率、微核細胞率；(2)放療前、放療20Gy、60Gy時行腮腺ECI檢測，記錄左、右腮腺攝取功能、排泌功能，計算20Gy、60Gy時左、右腮腺攝取功能減退率、排泌功能減退率；(3)放療前、放療50Gy、放療結(jié)束后3個月時行鼻咽MRI檢查，觀察放療

9、50Gy時鼻咽腫瘤消退率及放療結(jié)束后3個月時有無殘留病灶； (4)每周2次臨床檢查，記錄皮膚、粘膜RTOG／EORTC II級反應(yīng)出現(xiàn)時的外照射初始劑量。統(tǒng)計分析在正常組織皮膚、粘膜敏感組與不敏感組間、鼻咽腫瘤組織局控組與殘留組間，‘微核率、微核細胞率、左右腮腺攝取功能減退率、左右腮腺排泌功能減退率、50Gy鼻咽腫瘤消退率等指標間有無差異，并分析這些指標間相互關(guān)系。 [結(jié)果] 1．鼻咽腫瘤組織免疫組化檢測結(jié)果

10、 P53、VEGF、Survivin、VEGF-C、Ki67蛋白陽性率分別為65.0％、57.5％、60.8％、42.5％、57.5％，P53、VEGF、MVD復(fù)發(fā)組表達明顯比局控組高，差異有顯著性，而Survivin、VEGF-C、Ki67蛋白表達在兩組間無差異。P53、VEGF、MVD三者間顯著正相關(guān)，Survivin與P53及VEGF-C相關(guān)，Ki67與其他指標間無相關(guān)性。 2．用松胞素阻滯微核法檢測鼻咽癌細胞株放

11、射敏感性結(jié)果 克隆形成法顯示：在2Gy及以上劑量照射時，CNE2存活分數(shù)SF明顯比CNEl低。用SPSS二次模型對劑量與SF擬合，CNE2的α值、α／B值均較CNEl大，SF2觀察值及擬合值均較CNEl小。 松胞素阻滯微核法顯示：在1Gy及以上劑量照射時，CNE2的MNF、MNCF明顯比CNEl大。MNF、MNCF與照射劑量間呈線性正相關(guān)。 CNEl、CNE2的SF與MNF、MNCF間明顯負相關(guān)(P<

12、0.01)。 3．外周血松胞素阻滯微核法等檢測鼻咽癌放療反應(yīng)結(jié)果 (1)在體外照射1Gy及以上劑量時、20Gy、60Gy時外周血MNF、MNCF在放射敏感組明顯比不敏感組增加，但在放療前自發(fā)性MNF及MNCF、0.5Gy小劑量照射下誘發(fā)的MNF及MNCF在兩組間無明顯差異；在體外照射2Gy及以上劑量時、20Gy、60Gy時外周血MNF、MNCF在腫瘤局控組比殘留組明顯增加，但在放療前自發(fā)性MNF及MNCF、0.5Gy及1

13、Gy小劑量照射下誘發(fā)的MNF及MNCF在兩組間無明顯差異。 (2)在放射敏感組，左右腮腺排泌功能減退率在20Gy、60Gy均較不敏感組更明顯，而攝取功能減退率兩組間無差異。在局部控制組，60Gy時左右腮腺、20Gy時右腮腺排泌功能減退較殘留組更明顯，但20 Gy左腮腺排泌功能減退兩組間無差異。在局部控制組，右腮腺攝取功能減退在20Gy、60Gy時均較殘留組明顯，而左腮腺功能攝取功能減退兩組間無差異。 (3)在放射敏感

14、組，年齡明顯較不敏感組大；50Gy腫瘤消退率、腫瘤總分期、T、N分期、放療前腫瘤體積、化療、性別在放射敏感組與不敏感組間比較無明顯差異。 在局控組，50Gy腫瘤消退率明顯比殘留組更大，年齡也明顯比殘留組更大。腫瘤總分期、T、N分期、放療前腫瘤體積、化療、性別在腫瘤局控組與殘留組間比較無明顯差異。 (4)左右腮腺攝取功能減退率在放療20Gy至60Gy變化不明顯，無損傷率在28／42(66.67％)以上，2級

15、以上的減退率在8／42(19.05％)以下，無極度減退者。左右腮腺排泌功能減退極為明顯，20Gy時中度以上減退者、極度減退者分別達27／42(64.29％)、19／42(45.24％)以上， 60Gy時中度以上減退者、極度減退者則分別達37／42(88.10％)、33／42(78.57％)以上，60Gy與20Gy比較差異明顯(P<0.01)；電離輻射主要影響腮腺的排泌功能，并隨劑量增加而加重損傷；對腮腺的攝取功能影響較輕，未發(fā)現(xiàn)隨劑量

16、增加而急性損傷加重現(xiàn)象。 【結(jié)論】 1． 對120例鼻咽癌病人回顧性病例對照研究發(fā)現(xiàn)，P53、VEGF蛋白表達、 微血管密度在5年射野內(nèi)復(fù)發(fā)組明顯較局控組高，有可能作為預(yù)測鼻咽癌放射治療后局控率的指標；而Survivin、Ki67、VEGF-C蛋白表達兩組間無明顯差異。 2．松胞素阻滯微核法敏感地檢測出了鼻咽癌細胞株CNE1、CNE2的放射敏感性差異，與克隆形成法結(jié)果一致，提示松胞素阻滯微核法應(yīng)用于鼻咽癌

17、細胞株放射敏感性檢測敏感、準確、快速、簡便。 3．皮膚、粘膜急性反應(yīng)敏感組外周血淋巴細胞微核率、微核細胞率在體外照射1Gy及以上劑量時及外照射20Gy、60Gy時與不敏感組比較有明顯增加，提示外周血淋巴細胞松胞素阻滯微核法的微核率、微核細胞率有可能作為預(yù)測鼻咽癌皮膚、粘膜急性反應(yīng)敏感性的指標。 4．腮腺ECT動態(tài)檢測結(jié)果顯示，射線主要損傷腮腺的排泌功能，在皮膚、粘膜放射反應(yīng)敏感組，與不敏感組比較，20Gy、60Gy時左右