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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:應(yīng)用SAMP8小鼠為研究對(duì)象,觀察去卵巢及雌激素補(bǔ)充治療對(duì)SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶、海馬神經(jīng)元的影響以及對(duì)海馬nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元的作用。探討雌激素改善學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制,為雌激素補(bǔ)充治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法:選用6月齡雌性SAMP8小鼠45只,隨機(jī)分為假手術(shù)組(SHAM組),去卵巢組(OVX組)和去卵巢+雌激素組(OVX+E組)3組各15只,另外再選取SAMR1(R1組)雌性小鼠15只作為SAMP8小鼠的同源正常對(duì)照組
2、。SHAM組、R1組在暴露雙側(cè)卵巢后即縫合傷口,OVX組和OVX+E組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。術(shù)后OVX+E組每3天肌注一次苯甲酸雌二醇5g/只,其余各組均肌注等量的無(wú)菌芝麻油,共持續(xù)3個(gè)月。
1.Morris水迷宮試驗(yàn):給藥結(jié)束后,將小鼠在水迷宮中適應(yīng)環(huán)境1天。試驗(yàn)在每天上午進(jìn)行。首先定位航行試驗(yàn):將Morris水迷宮均分為4個(gè)象限,平臺(tái)放入其中1個(gè)象限中。小鼠分別自4個(gè)象限面向池壁入水,視頻采集系統(tǒng)跟蹤并記錄找到平臺(tái)所需的時(shí)
3、間。在第6天撤掉平臺(tái)進(jìn)行空間探索試驗(yàn),記錄小鼠120s內(nèi)跨越平臺(tái)的次數(shù)。
2.透射電鏡標(biāo)本制備、觀察:小鼠給予6%水合氯醛腹腔注射麻醉,經(jīng)左心室-升主動(dòng)脈插管,同時(shí)剪開(kāi)右心耳,用生理鹽水快速?zèng)_洗,用2%多聚甲醛-2%戊二醛混合固定液常生理鹽水快速?zèng)_洗,用2%多聚甲醛-2%戊二醛混合固定液常規(guī)灌注固定,持續(xù)1h,取鼠腦海馬CA1區(qū)組織塊放入固定液中,經(jīng)1%鋨酸固定1.5h(4℃)、常規(guī)脫水、100%丙酮脫水、包埋液包埋、半薄
4、切片定位錐體細(xì)胞層、超薄切片、重金屬電子染色后用H-7500型透射電鏡觀察海馬CA1區(qū)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并拍照。
3.HE染色、免疫組化的觀察:小鼠給予6%水合氯醛腹腔注射麻醉,經(jīng)左心室-升主動(dòng)脈插管,同時(shí)剪開(kāi)右心耳,用生理鹽水沖洗,4%多聚甲醛灌注1h。自上丘至視交叉節(jié)段取腦組織,制備二套石蠟切片,分別用于HE染色,抗nNOS免疫組化染色。
4.流式細(xì)胞儀檢測(cè):將小鼠斷頭取腦,迅速于冰盤(pán)上剝離海馬組織,于4℃70
5、%乙醇中固定。采用網(wǎng)搓法制備單細(xì)胞懸液,抗nNOS多克隆抗體孵育,流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果:
1.Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果:定位航行試驗(yàn):OVX組與SHAM組和OVX+E組相比明顯延長(zhǎng)(P<0.05),OVX+E組與SHAM組比較,每天的逃避潛伏期差別不明顯(P>0.05),空間探索試驗(yàn):OVX組的游泳軌跡主要呈隨機(jī)分布狀態(tài),SHAM組和OVX+E組的游泳軌跡主要集中在原平臺(tái)象限區(qū)域,且OVX組跨越平臺(tái)次
6、數(shù)少于SHAM組和OVX+E組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),OVX+E組與SHAM組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
2.HE染色觀察結(jié)果:OVX組:CA1區(qū)細(xì)胞層次排列絮亂,細(xì)胞間隙增大,細(xì)胞數(shù)量明顯減少,大量錐體細(xì)胞空泡變及濃染。OVX+E組:CA1區(qū)細(xì)胞層次排列尚規(guī)整,細(xì)胞間隙增大不明顯,少量錐體細(xì)胞濃染。SHAM組:CA1區(qū)錐體細(xì)胞病變情況與OVX+E組基本相同。R1組:CA1錐體細(xì)胞層次清楚,排列整齊緊密
7、均勻,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,核仁清晰可見(jiàn)。
3.透射電鏡觀察結(jié)果:OVX組:CA1區(qū)大部分錐體細(xì)胞核膜結(jié)構(gòu)模糊不清,染色質(zhì)邊集以及大量脂褐素顆粒沉積,線粒體腫脹明顯。OVX+E組:CA1區(qū)多數(shù)錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整,核仁明顯,染色質(zhì)分布均勻,線粒體大小及形態(tài)正常,個(gè)別細(xì)胞可見(jiàn)核膜雙層結(jié)構(gòu)不清晰和染色質(zhì)邊際現(xiàn)象以及少量脂褐素顆粒沉積。SHAM組與OVX+E組情況基本一致。R1組:CA1區(qū)錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,核膜雙層結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn),核仁明顯,
8、染色質(zhì)分布均勻,胞質(zhì)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和核糖體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完好,線粒體大小及形態(tài)正常。
4.免疫組化試驗(yàn)觀察結(jié)果:OVX組陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量及光密度值明顯低于SHAM組和OVX+E組(P<0.05),OVX+E組與SHAM組比較無(wú)明顯差別(P>0.05)。
5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)nNOS FI值結(jié)果表明,OVX組低于SHAM組和OVX+E組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。OVX+E組與SHA
9、M組相比兩者差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
結(jié)論:
1.SAMP8小鼠去卵巢后,雌激素的缺乏導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降;雌激素補(bǔ)充治療能減輕內(nèi)源性雌激素下降對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能的損害,改善學(xué)習(xí)記憶能力。
2.SAMP8小鼠去卵巢后,雌激素缺乏導(dǎo)致海馬神經(jīng)元排列疏松紊亂、細(xì)胞腫脹變性,細(xì)胞數(shù)目減少,超微結(jié)構(gòu)受損;雌激素補(bǔ)充治療能改善病理?yè)p傷,減少神經(jīng)元的丟失。
3.SAMP8小鼠去卵巢后,雌
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