雄激素對SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬神經(jīng)元的影響.pdf

1、目的：應(yīng)用SAMP8小鼠為研究對象，觀察去勢及雄激素補(bǔ)充治療對其學(xué)習(xí)記憶能力和海馬神經(jīng)元的影響，初步探討雄激素改善學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制，為雄激素替代治療提供實驗依據(jù)。 方法：選用健康雄性7月齡快速老化SAMP8小鼠48只。隨機(jī)分為假手術(shù)對照組(簡稱P8組)、去勢組、去勢+雄激素補(bǔ)充治療組(簡稱雄激素組)。選取16只雄性SAMR1小鼠作為同源正常對照組(簡稱R1組)。去勢組和雄激素組小鼠切除睪丸。雄激素組于去勢術(shù)1w后肌肉注射十一酸

2、睪酮(TU)37.4mg·kg-1·15d-1，其余各組注射等量無菌芝麻油，注射3次，共45d。 1.Morris水迷宮試驗：給藥結(jié)束后，小鼠在迷宮實驗室環(huán)境下飼養(yǎng)2d。訓(xùn)練在每天上午8:00～12:00間進(jìn)行。定位航行試驗：將Morris水迷宮均分為4個象限,平臺放入其中1個象限中。小鼠自第一象限中點面向池壁入水，視頻采集系統(tǒng)跟蹤并記錄找到平臺所需的時間。5d后撤掉平臺進(jìn)行探索試驗，記錄小鼠120s內(nèi)跨越平臺的次數(shù)。

3、2.組織切片制備及觀察：每組取10只小鼠，將輸液針刺入左心室，同時剪開右心耳，用生理鹽水沖洗，4％多聚甲醛灌注。自上丘至視交叉節(jié)段取腦組織，制備五套石蠟切片，分別用于HE染色，Nissl染色，TUNEL染色，抗Aβ免疫組化染色和陰性對照。 3.流式細(xì)胞儀檢測海馬細(xì)胞凋亡：每組取5只小鼠，斷頭取腦，迅速于冰盤上剝離海馬組織，4℃70％乙醇中固定。采用網(wǎng)搓法制備單細(xì)胞懸液，碘化丙啶進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。 4.海馬CA

4、1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)觀察：迅速游離海馬，置于4％預(yù)冷的戊二醛溶液中固定，將海馬切成厚約lmm的橫斷薄片，1h后再次切成＜1mm3的海馬CA1區(qū)組織塊，鋨酸固定，脫水，樹脂包埋，LKB-5超薄切片機(jī)切片，厚度50nm。醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察。 結(jié)果： 1.Morris水迷宮實驗結(jié)果：去勢組定位航行試驗潛伏期明顯長于其他組(P＜0.05)，探索試驗跨越平臺次數(shù)減少(P＜0.05)。TU補(bǔ)充治療能改善學(xué)習(xí)記憶能力，與

5、假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 2.HE染色結(jié)果：R1組海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)元排列緊密整齊，層次清楚。P8組神經(jīng)元排列較疏松紊亂，細(xì)胞層數(shù)減少。去勢組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元彌漫性空泡變性，細(xì)胞排列疏松、紊亂，細(xì)胞腫脹，核深染、固縮現(xiàn)象明顯。雄激素組神經(jīng)元病理改變較去勢組有明顯改善。 3.Nissl染色結(jié)果：R1組海馬神經(jīng)元胞漿中尼氏體豐富致密，細(xì)胞數(shù)較多，與其它各組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

6、P8組海馬神經(jīng)元尼氏體較稀疏。去勢組海馬神經(jīng)元數(shù)目較P8組明顯減少，細(xì)胞核固縮、濃密深染，胞漿內(nèi)尼氏體減少，部分缺失。雄激素補(bǔ)充治療后，細(xì)胞數(shù)較去勢組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但與P8組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 4.TUNEL染色結(jié)果：R1組存在少量散在的TUNEL陽性細(xì)胞。P8組陽性細(xì)胞數(shù)較R1組明顯增加(P＜0.05)。去勢組存在大量強(qiáng)陽性細(xì)胞，且核邊界清晰，大小不一，多有核周空暈，TUNEL陽性

7、細(xì)胞較P8組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。雄激素組陽性細(xì)胞表達(dá)較去勢組減弱(P＜0.05)，與P8組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。 5.抗Aβ免疫組化染色結(jié)果：去勢組Aβ陽性神經(jīng)元染色深，其數(shù)目及吸光度明顯高于其他組(P＜0.05)。雄激素組Ap陽性細(xì)胞數(shù)目及吸光度較去勢組明顯減少(P＜0.05)。 6.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果：去勢組出現(xiàn)了一個較高的亞二倍體峰，細(xì)胞凋亡率達(dá)到32.66±4.60％，與P8組

8、凋亡率21.19±3.96％以及雄激素組凋亡率20.78±3.08％相比明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而P8組和雄激素組間凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 7.電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果：電鏡觀察R1組神經(jīng)元核膜完整光滑，核內(nèi)染色質(zhì)均勻，電子密度低，線粒體豐富。P8組神經(jīng)元核膜雙層結(jié)構(gòu)較完整，線粒體正?；蜉p微腫脹，有少量脂褐素沉積，核內(nèi)染色質(zhì)電子密度略高。去勢組神經(jīng)元核膜雙層結(jié)構(gòu)消失融散，線粒體腫脹變性，嵴斷裂

9、，脂褐素沉積，核內(nèi)染色質(zhì)聚集成團(tuán)、邊集，形成不規(guī)則的高電子密度團(tuán)塊，有些出現(xiàn)凋亡小體。雄激素組超微結(jié)構(gòu)損傷較去勢組減輕，神經(jīng)元核膜較清晰，核內(nèi)染色質(zhì)邊集不明顯，線粒體形態(tài)未見明顯異常，脂褐素沉積減少。 結(jié)論： 1.SAMP8小鼠去勢后，雄激素缺乏導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降；雄激素補(bǔ)充治療能減輕內(nèi)源性雄激素下降對學(xué)習(xí)記憶功能的損害，改善學(xué)習(xí)記憶能力。 2.SAMP8小鼠去勢后，雄激素缺乏導(dǎo)致海馬神經(jīng)元疏松紊亂、腫脹變性，