Cx43和Cx37在多囊卵巢綜合征大鼠卵巢中的表達(dá)及意義.pdf

1、多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是育齡婦女最常見(jiàn)的一種極為復(fù)雜的內(nèi)分泌紊亂綜合征,以雄激素過(guò)多及持續(xù)無(wú)排卵為特征,發(fā)病率占育齡婦女的5％~10％。1935年由Stein和Leventhal兩位學(xué)者首先發(fā)現(xiàn),當(dāng)時(shí)稱(chēng)之為S—L綜合征。
　　傳統(tǒng)上認(rèn)為PCOS的特點(diǎn)為過(guò)多雄激素、無(wú)排卵、不孕、多毛、肥胖和子宮內(nèi)膜癌風(fēng)險(xiǎn),隨著臨床實(shí)踐及實(shí)驗(yàn)研究的深入,最近認(rèn)識(shí)到PCOS不僅涉及生殖系統(tǒng),而

2、且是一種代謝綜合征,常發(fā)生高胰島素血癥、高血脂、糖尿病和心血管疾病,在治療上涉及月經(jīng)失調(diào)、生育問(wèn)題、子宮內(nèi)膜增生、遠(yuǎn)期代謝合并癥等多學(xué)科問(wèn)題。其發(fā)病機(jī)制目前還不清楚,是當(dāng)前婦科內(nèi)分泌領(lǐng)域研究的一個(gè)難點(diǎn)和熱點(diǎn)。卵巢中的卵泡處于無(wú)血管的微環(huán)境中,在卵泡發(fā)育過(guò)程中,卵母細(xì)胞發(fā)育所需營(yíng)養(yǎng)以及與外界的信號(hào)交流都要通過(guò)卵母細(xì)胞與周?chē)w粒細(xì)胞以及顆粒細(xì)胞與膜細(xì)胞之間的細(xì)胞連接來(lái)實(shí)現(xiàn)。間隙連接是普遍存在于相鄰細(xì)胞間的細(xì)胞連接方式,它由一組名為間隙連接蛋

3、白(connexin,Cx)的膜蛋白組成。
　　間隙連接介導(dǎo)卵泡細(xì)胞間的代謝交換,傳遞內(nèi)分泌和旁分泌的信息物質(zhì),因而卵泡細(xì)胞間的間隙連接對(duì)于卵泡的發(fā)育、卵母細(xì)胞的成熟、以及甾類(lèi)激素的分泌,都具有十分重要的意義。Cx43和Cx37是許多物種卵巢間隙連接中數(shù)量最豐富的兩種連接蛋白,與卵泡發(fā)育的關(guān)系最為密切。它們?cè)诼炎影l(fā)生和卵泡發(fā)育中必不可少的作用已經(jīng)確立。據(jù)報(bào)道,Cx43與腫瘤、分娩、心血管疾病及神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)疾病均有一定關(guān)系。另

4、外,它還參與了凋亡、炎癥等過(guò)程。國(guó)內(nèi)外對(duì)Cx43的研究多集中在腫瘤和心血管系統(tǒng)。近年來(lái)對(duì)Cx43在卵巢發(fā)育中的作用研究也逐漸增多和深入。有研究顯示,在正常卵巢中,Cx43似乎擔(dān)當(dāng)了一個(gè)抑癌因子的作用。它與卵巢腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。通過(guò)基因敲除小鼠研究顯示,Cx43的缺失導(dǎo)致了卵子發(fā)生、卵泡發(fā)育、排卵、和早期胚胎發(fā)育的嚴(yán)重受損。
　　它從以下幾個(gè)環(huán)節(jié)影響卵泡發(fā)育:對(duì)原始生殖細(xì)胞遷移和胚胎卵巢發(fā)育起關(guān)鍵作用;它保證了顆粒細(xì)胞的正常增殖和

5、分層,維持了卵泡的正常發(fā)育和結(jié)構(gòu);抗顆粒細(xì)胞凋亡,利于卵泡選擇;在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)中起重要作用。另外,在卵巢重塑的關(guān)鍵時(shí)期:排卵、黃體形成、分化和退化中也起重要作用。許多激素及細(xì)胞因子如黃體酮、促黃體生成激素、促卵泡激素、生長(zhǎng)激素等在轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)等水平通過(guò)影響Cx43通道的開(kāi)放、關(guān)閉時(shí)間,或使其磷酸化進(jìn)行調(diào)節(jié)。在卵巢中,Cx37主要表達(dá)在卵母細(xì)胞與周?chē)w粒細(xì)胞之間的間隙連接中,構(gòu)成了二者物質(zhì)交流的通道。有研究報(bào)道,Cx37在卵

6、泡發(fā)育早期缺失,導(dǎo)致了卵泡發(fā)育停滯在竇前階段,竇狀卵泡較少;黃體化過(guò)程提前,卵母細(xì)胞過(guò)早停止發(fā)育,不能進(jìn)行減數(shù)分裂;促性腺激素不能誘導(dǎo)卵泡發(fā)育成熟并排卵。因臨床取材困難,目前常用大鼠模型來(lái)進(jìn)行PCOS發(fā)病機(jī)制的研究。
　　本研究通過(guò)建立來(lái)曲唑誘導(dǎo)的PCOS大鼠模型,應(yīng)用免疫組化方法觀察Cx43和Cx37在正常及多囊卵巢綜合征大鼠卵巢中的表達(dá)變化,從而探討PCOS的發(fā)病機(jī)制。
　　材料與方法：
　　1、研究對(duì)象及分組選擇

7、6周齡清潔級(jí)雌性SD大鼠60只,所有大鼠由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(豫)2005—0001,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和空白對(duì)照組,每組20只。
　　2、方法
　　2.1 PCOS模型的建立實(shí)驗(yàn)組大鼠灌胃服用溶于1％羧甲基纖維素(carboxmethlycellulose,CMC)的來(lái)曲唑1mg.(kg.d)-1,實(shí)驗(yàn)對(duì)照組灌胃服用等容積的1％CMC,實(shí)驗(yàn)組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組均連續(xù)灌服21天;空白對(duì)照組不給

8、以任何刺激,正常飼養(yǎng)21天。此期所有大鼠須每日做陰道脫落細(xì)胞涂片巴氏染色后鏡檢監(jiān)測(cè)其動(dòng)情周期的變化。2.2大鼠標(biāo)本采集2.2.1實(shí)驗(yàn)組大鼠在第21天應(yīng)用來(lái)曲唑24h(并禁食12h)后處死取標(biāo)本。2.2.2實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和空白對(duì)照組在飼養(yǎng)21天并禁食12h后處死取標(biāo)本。2.2.3所有大鼠缺血法致死,取大鼠心臟血5ml,2000r/min離心10min,收集血清,-20℃凍存?zhèn)溆谩Ｈ〕龃笫舐殉埠妥訉m,分別稱(chēng)重并記錄后,固定于福爾馬林中備用。2.

9、3大鼠卵巢組織學(xué)檢查以卵巢最大平面作為待檢平面行石蠟包埋,每個(gè)石蠟塊分別以4μm厚度連續(xù)切片兩次(間隔40μm),行蘇木素-伊紅(HE)染色。2.4大鼠血清性激素測(cè)定應(yīng)用RIA法測(cè)定促黃體生成激素(luteinizing hormone,LH)、促卵泡激素(follicle stimulating hormone,FSH)、雌二醇(estradiol,E2)、孕酮(progesterone,P)、睪酮(testoterone,T),以評(píng)

10、定內(nèi)分泌改變。2.5大鼠卵巢組織中Cx43和Cx37的表達(dá)2.5.1應(yīng)用免疫組化SP法進(jìn)行組織染色,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。2.5.2免疫組化染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照,以細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性結(jié)果。陽(yáng)性細(xì)胞必須符合下列要求:鏡下組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚;陽(yáng)性顆粒定位好;染色明顯高于背景。2.5.3拍片及測(cè)灰度值:拍攝免疫組化染色照片并保存。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野,采用Biosens Digital Imaging

11、 System系統(tǒng)進(jìn)行圖像灰度值分析。2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有數(shù)據(jù)均以(?)±s表示,多組均數(shù)之間的比較采用單因素方差分析,以a=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果：
　　1、PCOS大鼠模型
　　1.1大鼠動(dòng)情周期的變化:實(shí)驗(yàn)組大鼠在應(yīng)用來(lái)曲唑12天后動(dòng)情周期失去規(guī)律性變化,均處于動(dòng)情間期時(shí)相,提示無(wú)排卵;實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和空白對(duì)照組大鼠仍保持4天規(guī)律的動(dòng)情周期。1.2大鼠卵巢、子宮大

12、體觀及組織學(xué)改變:實(shí)驗(yàn)組大鼠卵巢表面較蒼白,體積增大;實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和空白對(duì)照組大鼠卵巢色澤較紅;實(shí)驗(yàn)組大鼠卵巢重量顯著高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及空白對(duì)照組(P<0.05)。HE染色鏡檢,實(shí)驗(yàn)組大鼠卵巢膜細(xì)胞層增厚,沿增厚的白膜下含有很多處于不同期的各級(jí)卵泡和閉鎖卵泡,囊狀擴(kuò)張卵泡明顯增加;間質(zhì)細(xì)胞明顯增生,未見(jiàn)排卵前卵泡及排卵跡象,黃體罕見(jiàn);實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和空白對(duì)照組大鼠卵巢可見(jiàn)多個(gè)黃體及不同發(fā)育階段的卵泡,卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞呈多層,仍有排卵。實(shí)驗(yàn)組大鼠子

13、宮重量顯著低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及空白對(duì)照組(P<0.05)。1.3鼠血清性激素測(cè)定:實(shí)驗(yàn)組大鼠血清T、LH濃度顯著高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及空白對(duì)照組(P<0.05);實(shí)驗(yàn)組大鼠血清FSH、E2、P濃度顯著低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及空白對(duì)照組(P<0.05)。
　　2、大鼠卵巢組織中Cx43和Cx37的表達(dá)在卵巢中Cx43主要在顆粒細(xì)胞間表達(dá),在實(shí)驗(yàn)組大鼠卵巢中表達(dá)水平顯著低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)。卵巢中Cx37主要在卵母細(xì)胞與周?chē)w粒細(xì)