Cx43及Cx43-hemichannel在大鼠全腦缺血再灌注損傷中的作用.pdf

1、研究背景:
　　 腦血管病(cerebrovasculardisease，CVD)以突發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙為特點，臨床多表現(xiàn)為急性偏癱、失語、驚厥、意識障礙、顱內(nèi)壓增高等，是導致人類死亡的三大主要疾病之一。根據(jù)病理特點，可分為缺血性和出血性兩大類，其中缺血性占絕大多數(shù)。臨床上，腦梗死、心肌梗死、休克、新生兒窒息、新生兒缺氧缺血性腦病、腦外傷等都可引起腦缺血性損害。對腦缺血的研究目前有成熟的體內(nèi)、體外模型，體內(nèi)模型有全腦缺血模型和

2、局灶性腦缺血模型，體外模型主要為單純?nèi)毖跄Ｐ秃脱跆莿儕Z模型，但各模型都無法完全模擬人類復雜的腦缺血病理過程。目前對缺血性腦血管病的研究主要集中在再灌注損傷對最終梗死灶體積的影響方面，普遍認為再灌注損傷以細胞凋亡為主。對神經(jīng)細胞凋亡的研究中大多以神經(jīng)元為主，而對數(shù)量龐大、作用廣泛的神經(jīng)膠質(zhì)細胞涉及很少。
　　 半胱氨酸天冬酶-3(Cysteinylaspartate-specificprotease-3，Caspase-3)是目前

3、研究較多和比較明確的一種凋亡因子，是細胞凋亡級聯(lián)反應下游最關(guān)鍵的蛋白酶，是各種因素啟動的凋亡程序的必經(jīng)之路。多項研究發(fā)現(xiàn)腦損傷后星形膠質(zhì)細胞可表達Caspase-3，其表達量與凋亡指數(shù)呈正比，提示Caspase-3亦與神經(jīng)膠質(zhì)細胞凋亡有關(guān)。
　　 縫隙連接(gapjunction，GJ)是相鄰細胞間的跨膜通道，由相鄰細胞膜上的兩個半通道(hemichannels)相互錨定組成?？p隙連接蛋白(connexin，Cx)是這兩種通道的

4、結(jié)構(gòu)蛋白，Cx43是Cx家族中數(shù)量最為豐富的成員，且已證實Cx43在人及大鼠的神經(jīng)膠質(zhì)細胞中存在?？p隙連接能在細胞間傳輸毒性代謝產(chǎn)物和能量，其可能對腦損傷的擴散或修復有影響。已發(fā)現(xiàn)使用縫隙連接阻斷劑可減輕腦缺血或缺血再灌注引起的腦損傷，減小梗死面積。但從基因方面抑制縫隙連接形成反而使細胞或組織更易受損。因此，縫隙連接對腦損傷是否起保護作用仍存在爭論，可能與縫隙連接阻斷劑缺乏特異性有關(guān)。近來發(fā)現(xiàn)細胞膜上未配對的半通道是可以單獨存在的，并在

5、許多病理生理情況下開放，其開放可致細胞凋亡及腦損傷加重。越來越多研究證明縫隙連接及半通道與創(chuàng)傷愈合、心肌梗死、心律失常、腦梗死、癲癇、腫瘤等都有密切關(guān)系?？p隙連接蛋白(Cx)的研究主要集中在線粒體、細胞核中的Cx對細胞死亡及增殖的抑制，相關(guān)機制仍不十分明確。
　　 既然縫隙連接、半通道都與腦損傷相關(guān)，二者的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)Cx又與細胞死亡有關(guān)，而神經(jīng)膠質(zhì)細胞的存亡決定腦損傷的預后，我們考慮可以從Cx、縫隙連接及半通道入手，研究三者對神經(jīng)

6、膠質(zhì)細胞凋亡的影響及在缺血再灌注損傷中的作用。因此，我們選擇大鼠全腦缺血再灌注模型，檢測再灌注期間Caspase-3、Cx43及Cx43-hemichannel(Cx43-hcl)蛋白的表達變化（其中對Cx43-hemichannel表達的檢測國內(nèi)鮮有報道），證明Cx43及Cx43-hemichannel可能通過促進神經(jīng)膠質(zhì)細胞凋亡而參與腦缺血再灌注損傷，為缺血性腦血管病的臨床治療提供新的理論依據(jù)。
　　 目的:
　　

7、研究大鼠全腦缺血再灌注損傷致半胱氨酸天冬酶-3(Caspase-3)、縫隙連接蛋白43(Connexin43，Cx43)及其半通道蛋白(Cx43-hemichannel)的表達變化，探討Cx43及Cx43-hemichannel在腦缺血再灌注損傷中的作用，為腦缺血的治療尋找新的理論基礎(chǔ)和治療手段。
　　 方法:
　　 健康成年雄性Wistar大鼠56只（造模失敗后補充動物），體重270-320g，隨機分為假手術(shù)組（Sha

8、m組）、全腦缺血10min再灌注0.5h組（IR/0.5h組）、全腦缺血10min再灌注6h組(IR/6h組)、全腦缺血10min再灌注24h組(IR/24h組），每組14只動物，8只用于免疫熒光組化，6只用于免疫印跡(Westernblot)。采用改良的Pulsinelli四血管閉塞法(4-V0)制作大鼠全腦缺血再灌注模型，各組大鼠在預定時間點斷頭取腦，分別采用免疫熒光組織化學方法和免疫印跡方法檢測各組大鼠側(cè)腦室室下區(qū)(thesubv

9、entricularzone，SVZ)Caspase-3、Cx43和Cx43-hemichannel的表達變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.動物模型制備56只成年雄性Wistar大鼠中全腦缺血再灌注模型制備成功47只（造模失敗后補充動物），成功率84％，9只造模失敗的大鼠中死亡4只（麻醉意外2只，手術(shù)過程中出現(xiàn)誤吸1只，分離頸總動脈時造成大出血1只），不符合模型標準5只（未出現(xiàn)瞳孔變大3只，術(shù)中或術(shù)后出現(xiàn)驚厥樣抽搐2只）;

10、
　　 2.免疫熒光組織化學方法顯示假手術(shù)組見極少量Caspase-3陽性表達，少量Cx43和Cx43-hemichannel陽性表達，在全腦缺血10min再灌注0.5h時各蛋白陽性表達開始增加，但與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），于再灌注6h和24h時各蛋白陽性表達明顯增加，以24小時為著，與假手術(shù)組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;
　　 3.免疫印跡法顯示Caspase-3、Cx43和Cx43

11、-hemichannel蛋白表達于全腦缺血10min再灌注0.5h時開始升高，但與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），于再灌注6h和24h時各蛋白陽性表達明顯增加，以24小時為著，與假手術(shù)組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 腦缺血再灌注損傷可致神經(jīng)膠質(zhì)細胞發(fā)生凋亡，Cx43及Cx43-hemichannel在神經(jīng)膠質(zhì)細胞凋亡過程中起到了促進作用，可能是缺血再灌注損傷發(fā)生及發(fā)展的機制