陸地棉農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化與利用.pdf

1、傳統(tǒng)的棉花農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化使用子葉和下胚軸為外植體，以Coker 312作為模式品種。由于其轉(zhuǎn)化和再生經(jīng)歷體細(xì)胞胚胎發(fā)生，所以該方法被認(rèn)為是棉花轉(zhuǎn)化的首選方法，并為棉花轉(zhuǎn)基因做出了巨大的貢獻(xiàn)。但這一體系受到了基因型的嚴(yán)重限制，即便是轉(zhuǎn)化成功了的品種仍然受轉(zhuǎn)化周期長(zhǎng)、成胚率低、易出現(xiàn)畸形胚、體細(xì)胞胚植株再生比例低和缺乏莖的伸長(zhǎng)等因素的限制。本研究對(duì)傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化，以長(zhǎng)江流域主栽品種泗棉3號(hào)為受體建立了下胚軸為外植體的高效的轉(zhuǎn)化體系

2、，并首次將插皮接用于棉花再生植株的嫁接；為了進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化的效率，建立和優(yōu)化了以泗棉3號(hào)胚性愈傷為受體的轉(zhuǎn)化體系，利用此體系已將多個(gè)基因成功導(dǎo)入泗棉3號(hào)；利用組織培養(yǎng)的方法對(duì)w0品系和泗棉3號(hào)的再生潛力進(jìn)行研究。研究的結(jié)果如下： 1.分析了影響傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化效率的因素；通過(guò)改變誘導(dǎo)愈傷時(shí)的氮素形態(tài)、及時(shí)挑選胚性愈傷、利用代謝脅迫促進(jìn)再生出苗等措施對(duì)轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化。對(duì)各種脅迫的直接和間接效應(yīng)以及不同氮素形態(tài)的供應(yīng)進(jìn)行了理論分

3、析，結(jié)果顯示氮素形態(tài)和透氣脅迫對(duì)體系的優(yōu)化至關(guān)重要。首次將插皮接技術(shù)用于棉花再生植株的繁殖，該技術(shù)要求簡(jiǎn)單，操作方便，成活率90％，延長(zhǎng)了砧木的使用時(shí)間，有效的縮短了再生植株緩苗時(shí)間。 2.以長(zhǎng)江流域棉區(qū)主栽陸地棉品種泗棉3號(hào)下胚軸為外植體建立了高效的轉(zhuǎn)化體系，得到了大量的轉(zhuǎn)基因植株，并提供了相關(guān)的分子證據(jù)和基因表達(dá)證據(jù)．發(fā)現(xiàn)泗棉3號(hào)出現(xiàn)分化中心的主要形態(tài)不同于Coker 312，其胚性愈傷組織主要來(lái)源于兩類初生愈傷組織．收獲到

4、部分To植株的種子，對(duì)它們的T1代植株進(jìn)行了PCR檢測(cè)和卡那霉素抗性鑒定；在T<,0>和R<,0>代獲得了豐富的花器官和株型變異體。 3.通過(guò)優(yōu)化胚性愈傷的繁殖、胚性愈傷的共轉(zhuǎn)化、選擇培養(yǎng)和分化成苗技術(shù)提高了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化棉花胚性愈傷體系的轉(zhuǎn)化效率．感染時(shí)受體愈傷狀態(tài)、共培養(yǎng)的效率和選擇培養(yǎng)基的選擇效率對(duì)轉(zhuǎn)化的效率至關(guān)重要。鮮黃的細(xì)顆粒狀胚性愈傷共轉(zhuǎn)化效率高；AS(乙酰丁香酮)50 mg．L<'-1>和共培養(yǎng)溫度19℃轉(zhuǎn)化效率最高，

5、AS和培養(yǎng)溫度存在顯著的互作。胚性愈傷接種盡量分散降低了假陽(yáng)性，提高了選擇效率。該轉(zhuǎn)化方法的周期為5～6個(gè)月，陽(yáng)性率為55.7％，平均每個(gè)克隆可獲得9.7株轉(zhuǎn)基因植株。采用胚性愈傷的轉(zhuǎn)化方法降低了工作量和成本，提高了轉(zhuǎn)化效率，使規(guī)模轉(zhuǎn)化棉花成為現(xiàn)實(shí)，為棉花的遺傳改良和棉花重要基因的功能分析奠定了基礎(chǔ)． 4．以組織培養(yǎng)為手段，對(duì)棉花再生能力進(jìn)行選擇同時(shí)對(duì)胚胎發(fā)生的時(shí)間和頻率、出現(xiàn)分化中心時(shí)愈傷的狀態(tài)和愈傷生長(zhǎng)量、以及再生植株有無(wú)

6、變異和育性進(jìn)行選擇，獲得了品系WO的再生純系；對(duì)泗棉3號(hào)進(jìn)行了第一輪的選擇，再生頻率由4.5％提高到40％左右，并獲得了一個(gè)由組培引起的可以遺傳的突變體． 5．采用優(yōu)化了的以下胚軸為外植體的轉(zhuǎn)化方法，經(jīng)分子驗(yàn)證和基因表達(dá)檢測(cè)(PCR、Southern、RT和點(diǎn)涂PPT)，成功的將bar基因?qū)肓四Ｊ狡贩NCokcr 312，獲得了高抗PPT的轉(zhuǎn)化植株．現(xiàn)已獲得T<,1>代抗性植株和1個(gè)可以遺傳的表型突變體，有待于進(jìn)一步純合和分析。