農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜鵑花遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、杜鵑花是我國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一，具有極高的觀賞價(jià)值，近年來在國(guó)內(nèi)外花卉市場(chǎng)上十分走俏。杜鵑花耐寒性強(qiáng)(可耐-39.4℃低溫)，但其嗜酸忌鹽的特性是栽培利用的最大限制因素?，F(xiàn)已證明液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NHX1基因，是植物抗鹽機(jī)制中的核心因子，具有抗鹽、調(diào)節(jié)pH值、改變花色的三重功能，已成功用于多種植物的抗鹽育種。本研究以映紅杜鵑葉片為外植體，對(duì)芽再生體系進(jìn)行了詳細(xì)的研究；同時(shí)采用基因工程的手段將由擬南芥(Arabidopsisth

2、aliana)cDNA中擴(kuò)增出的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtNHX1轉(zhuǎn)入到映紅杜鵑中，并對(duì)其遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了系統(tǒng)研究，以期獲得抗鹽耐堿的杜鵑花轉(zhuǎn)化系，為杜鵑花耐堿育種提供種質(zhì)資源，并且為工廠化育苗奠定基礎(chǔ)。
　　 本實(shí)驗(yàn)以映紅杜鵑愈傷組織為受體材料，首先利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將AtNHX1基因?qū)胗臣t杜鵑基因組中，同時(shí)對(duì)影響映紅杜鵑轉(zhuǎn)化效率的多個(gè)因素做了進(jìn)一步的探討，建立了映紅杜鵑遺傳轉(zhuǎn)化體系；然后對(duì)抗性植株進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)

3、證明AtNHX1成功轉(zhuǎn)入映紅杜鵑中。本研究的主要研究結(jié)果如下：
　　 1、映紅杜鵑芽再生體系的建立：以無菌苗葉片為外植體，1/4Anderson培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，誘導(dǎo)愈傷組織最佳培養(yǎng)基為1/4Anderson+2，4-D1mg/L+6-BA0.5mg/L；芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為1/4Anderson+IBA0.1mg/L+TDZ1mg/L；生根培養(yǎng)基為1/4Anderson+IAA2mg/L+NAA0.1mg/L。
　　

4、2、實(shí)驗(yàn)測(cè)試了卡那霉素對(duì)愈傷組織的影響，結(jié)果表明：映紅杜鵑愈傷組織對(duì)卡那霉素非常敏感，以Kan50mg/L作為最適篩選壓。
　　 3、抑菌劑頭孢霉素的濃度為500mg/L時(shí)，能完全抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)愈傷組織的再生影響最小。
　　 4、通過對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究，探討了預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、As濃度對(duì)農(nóng)桿菌T-DNA轉(zhuǎn)化效率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：愈傷組織預(yù)培養(yǎng)5d轉(zhuǎn)化效率最高，抗性愈傷組織頻

5、率達(dá)19％；農(nóng)桿菌菌液濃度為OD600=0.5時(shí)愈傷組織侵染效率最高；最適合愈傷組織侵染的時(shí)間為20min；共培養(yǎng)2d對(duì)愈傷組織轉(zhuǎn)化效果最好；共培養(yǎng)培養(yǎng)基添加濃度為20mg/L的As能顯著提高轉(zhuǎn)化效率。
　　 5、利用優(yōu)化的轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)，將Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtNHX1成功轉(zhuǎn)入映紅杜鵑基因組中，獲得了21株抗性植株。經(jīng)過RT-PCR檢測(cè)證明將AtNHX1成功轉(zhuǎn)入映紅杜鵑基因組中的有4株。
　　 6、轉(zhuǎn)基因杜鵑花