Erbin與plk1激酶相互作用的研究.pdf

1、背景:有絲分裂是細(xì)胞生命活動(dòng)的重要特征之一,從十九世紀(jì)末發(fā)現(xiàn)至今一直受到科學(xué)家的高度重視和關(guān)注,經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的探索和研究,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有絲分裂是受時(shí)間和空間上的復(fù)雜、精巧的調(diào)控過(guò)程。細(xì)胞有絲分裂異常會(huì)導(dǎo)致非整倍體(aueuploidy)細(xì)胞的增加,與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有密切的聯(lián)系。
　　經(jīng)漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程,細(xì)胞具備了能保證細(xì)胞周期DNA復(fù)制和染色體分配順利完成的檢查機(jī)制,被稱為細(xì)胞周期檢查點(diǎn)(cell cycle checkpoin

2、ts)。細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的調(diào)控機(jī)制是保證細(xì)胞周期事件按次序、正常發(fā)生的細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制,也是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵因素。細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的調(diào)控主要通過(guò)一系列酶來(lái)完成的,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,參與細(xì)胞有絲分裂重要的調(diào)控酶類主要有:Plk1, Cdk1等細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs),PP1,Cdc14等細(xì)胞周期的磷酸酶,紡錘體組裝檢查點(diǎn)(spindle assembly checkpoint,SAC)

3、和E3泛素連接酶后期促進(jìn)復(fù)合體等相關(guān)分子。
　　Plk1(Polo-like kinase1)是細(xì)胞周期有絲分裂重要的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶,在細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程中發(fā)揮極其重要的作用,在細(xì)胞周期不同亞期Plk1定位不同。到目前為止,已經(jīng)揭示有幾十個(gè)Plk1的底物,Plk1通過(guò)與這些底物相互作用來(lái)影響細(xì)胞周期有絲分裂的進(jìn)入、紡錘體的形成、姐妹染色單體間的分離、中心體的復(fù)制以及胞質(zhì)分裂的過(guò)程;另外,Plk1本身的亞細(xì)胞定位也受相應(yīng)底物的

4、調(diào)控。在人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,最主要的表現(xiàn)為細(xì)胞增殖異常和遷移能力的增加,激酶 Plk1是調(diào)控細(xì)胞有絲分裂的關(guān)鍵分子,經(jīng)大量的研究證實(shí)在腫瘤細(xì)胞中Plk1具有明顯的高表達(dá);在體外細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,低表達(dá)Plk1能夠有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其自身凋亡,但對(duì)正常細(xì)胞沒有明顯的影響。因此,在人類腫瘤的治療中,Plk1激酶的靶向治療很可能成為的潛在新方法。
　　Erbin(ErbB2 Interacting protein)

5、定位于細(xì)胞膜和相鄰細(xì)胞連接處,最早在2000年以癌基因ErbB2為誘餌通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)時(shí)被發(fā)現(xiàn),并因此而命名。我們實(shí)驗(yàn)室早期自主制備了Erbin抗體,在檢測(cè)Erbin抗體做免疫熒光時(shí)發(fā)現(xiàn),Erbin具有細(xì)胞周期依賴性表達(dá)升高和有絲分裂亞細(xì)胞動(dòng)態(tài)定位的特征,這些研究結(jié)果提示Erbin在細(xì)胞周期中對(duì)細(xì)胞有絲分裂可能具有重要的調(diào)控作用。我們也發(fā)現(xiàn)Erbin具有有絲分裂依賴的磷酸化修飾特征,其磷酸化發(fā)生與Plk1的激活時(shí)程(time patt

6、ern)相似,且在細(xì)胞周期有絲分裂中存在明顯的亞細(xì)胞共定位(中心體和中體),由此提示Erbin可能是Plk1新的底物蛋白;因此,本課題擬通過(guò)分析Plk1與Erbin的相互作用,探討Erbin作為Plk1新的底物蛋白對(duì)細(xì)胞有絲分裂的調(diào)控作用及機(jī)制。
　　目的:在細(xì)胞水平上研究Erbin是否具有細(xì)胞周期依賴性的表達(dá)及其磷酸化,在細(xì)胞有絲分裂周期中Erbin亞細(xì)胞定位的變化,揭示Plk1對(duì)Erbin磷酸化的影響及其在細(xì)胞有絲分裂中亞細(xì)胞

7、共定位,Erbin與Plk1相互作用的結(jié)構(gòu)域。初步探索Erbin對(duì)細(xì)胞有絲分裂的影響。
　　方法:通過(guò)細(xì)胞周期同步化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察Erbin細(xì)胞周期依賴性的表達(dá)及其磷酸化特征,研究Erbin與Plk1在細(xì)胞有絲分裂中磷酸化的關(guān)系。利用免疫熒光(IF)檢測(cè)細(xì)胞周期中Erbin亞細(xì)胞定位的動(dòng)態(tài)變化特征,檢測(cè)Erbin與Plk1在細(xì)胞周期有絲分裂中的共定位作用,檢測(cè)內(nèi)源和外源Erbin與Plk1相互作用的定位基礎(chǔ),檢測(cè)Erbin不同截?cái)?/p>

8、體的定位從而確定Erbin的核定位基礎(chǔ)。利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建相應(yīng)的載體,經(jīng)免疫共沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)內(nèi)源和外源Erbin與Plk1存在相互作用,利用Erbin和Plk1的不同結(jié)構(gòu)域的截?cái)囿w進(jìn)一步證實(shí)Erbin與Plk1相互作用的結(jié)構(gòu)域,并且經(jīng)過(guò)GST-Pull down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步佐證Erbin與Plk1的相互作用及其二者相互作用的結(jié)構(gòu)域。經(jīng)過(guò)序列比對(duì)分析實(shí)驗(yàn),推測(cè)并證實(shí)Cdk1是Plk1磷酸化Erbin的點(diǎn)火激酶。利用Erb

9、in siRNA干涉實(shí)驗(yàn)證明Erbin敲低對(duì)Plk1磷酸化的影響;利用流式細(xì)胞術(shù),經(jīng)Nocodazole同步化(M)釋放實(shí)驗(yàn),PI染色檢測(cè)Erbin siRNA干涉后對(duì)細(xì)胞周期的影響;經(jīng)DAPI和Golgin-97染色細(xì)胞核和高爾基體,檢測(cè)Erbin敲低對(duì)細(xì)胞有絲分裂細(xì)胞核的影響;在正常人乳腺細(xì)胞MCF-10A中敲低Erbin表達(dá),在倒置顯微鏡下有絲分裂細(xì)胞數(shù)的變化。
　　結(jié)果:首先我們利用抗微管藥物Nocodazole處理細(xì)胞使

10、細(xì)胞阻滯于G2/M期,分析G2/M期細(xì)胞裂解樣品中Erbin蛋白在電泳中的泳動(dòng),結(jié)果觀察到其遷移明顯變緩,而在λ磷酸酶處理可以翻轉(zhuǎn)Nocodazole引起的Erbin條帶遷移變緩現(xiàn)象,證實(shí)磷酸化修飾是引起Erbin在G2/M期條帶上移的原因,進(jìn)一步用雙胸腺嘧啶使細(xì)胞阻滯于G1/S期,然后釋放,觀察細(xì)胞在自然進(jìn)入M期時(shí) Erbin條帶泳動(dòng)的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Erbin在從G2進(jìn)入M期(T9-T11)時(shí)條帶明顯上移,并與激酶Plk1的活化pat

11、tern一致;而敲低Plk1可抑制Nocodazole引起的Erbin條帶上移,表達(dá)激活型Plk1和野生型Plk1可直接導(dǎo)致外源表達(dá)的Erbin條帶上移(轉(zhuǎn)染失活型的Plk1無(wú)此作用),以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)M期Erbin磷酸化依賴于激酶Plk1。此外我們亦初步證實(shí)Cdk1是Plk1磷酸化Erbin的點(diǎn)火激酶。進(jìn)一步我們利用免疫熒光觀察細(xì)胞周期中的Erbin具有明顯的中體和中心體定位,在有絲分裂前、中期Erbin與Plk1在中心體具有明顯的共

12、定位,在末期和胞質(zhì)分裂期兩者在中體有明顯的共定位。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)Erbin-PDZ結(jié)構(gòu)域與Plk1的催化區(qū)(Plk1-CD)相互作用,而Erbin-Inter區(qū)只與活化的Plk1發(fā)生相互作用。并GST-Pull down實(shí)驗(yàn)亦進(jìn)一步佐證Erbin與Plk1的相互作用,即Erbin-PDZ不與Plk1-PBD結(jié)合,而與Plk1-CD結(jié)合,而Plk1-PBD與磷酸化的Erbin-Inter區(qū)有更強(qiáng)的體外作用。這些相互作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,E

13、rbin是Plk1新的底物,Erbin被磷酸化的底物區(qū)域存在于Erbin-Inter區(qū),而Erbin-PDZ可能調(diào)控Plk1的活性。我們亦進(jìn)一步證實(shí)了過(guò)表達(dá)PDZ對(duì)Plk1磷酸化的抑制作用和延緩有絲分裂進(jìn)入。我們也觀察到慢病毒感染敲低Erbin15天后,細(xì)胞明顯分裂異常,主要表現(xiàn)為多核細(xì)胞顯著增強(qiáng)。
　　結(jié)論:本研究證明了Erbin具有細(xì)胞周期依賴性的表達(dá)及細(xì)胞周期有絲分裂的亞細(xì)胞定位動(dòng)態(tài)特征,并且具有有絲分裂依賴的磷酸化修飾現(xiàn)象

14、,與Plk1激酶存在明顯的相互作用,并且初步驗(yàn)證Cdk1是Plk1磷酸化Erbin中的“點(diǎn)火”(priming)激酶,Plk1磷酸化Erbin的底物結(jié)合區(qū)存在于Erbin-Inter區(qū),而Erbin-PDZ結(jié)構(gòu)域通過(guò)與Plk1-CD結(jié)構(gòu)域結(jié)合,可能空間位阻上干擾Plk1 T210的激活。以上結(jié)果提示,Erbin即作為Plk1的底物又可負(fù)調(diào)控Plk1活性,Erbin是一個(gè)重要的新的有絲分裂調(diào)控分子。Erbin敲低明顯促進(jìn)了細(xì)胞的增殖以及多