細(xì)胞周期調(diào)控蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及接頭分子TANK募集細(xì)胞周期激酶PLK1抑制NF-κB信號(hào)通路的機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞周期是生命的基本特征之一,其研究一直是生命科學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)。詳細(xì)了解細(xì)胞周期的功能、調(diào)控及其它潛在的分子機(jī)制,對(duì)生物工程及醫(yī)藥開發(fā)領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用價(jià)值。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用是生命活動(dòng)的基礎(chǔ),研究細(xì)胞周期調(diào)控蛋白質(zhì)在相互作用中形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)是全面分析和認(rèn)識(shí)細(xì)胞周期分子調(diào)控機(jī)理的重要手段。開展肝臟中細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)研究也是中國人類肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃(Chinese human liver proteome project,

2、CNHLPP)之蛋白質(zhì)相互作用連鎖圖研究專題的重要組成部分。
　　本研究采用ProQuestTM酵母雙雜交(yeast two-hybrid,Y2H)系統(tǒng),選擇與細(xì)胞周期驅(qū)動(dòng)和調(diào)控緊密相關(guān)且在肝臟中表達(dá)的蛋白質(zhì)作為誘餌,對(duì)成人肝臟cDNA文庫進(jìn)行篩選。細(xì)胞周期的驅(qū)動(dòng)及調(diào)控蛋白主要包括:細(xì)胞周期動(dòng)力系統(tǒng)即細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinase,CDK)和對(duì)其進(jìn)行控制的細(xì)胞周期蛋白(cyclin)、細(xì)胞

3、周期蛋白依賴性激酶抑制子(cyclin dependent kinase inhibitor,CKI);控制遺傳物質(zhì)復(fù)制起始的細(xì)胞周期正調(diào)控系統(tǒng)即周期限制點(diǎn)調(diào)控蛋白;保證細(xì)胞遺傳物質(zhì)復(fù)制和分配質(zhì)量的細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控系統(tǒng)即周期檢查點(diǎn)調(diào)控蛋白;對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行質(zhì)量控制的翻譯后修飾酶類和細(xì)胞周期相關(guān)生長(zhǎng)因子及受體等。我們最終成功構(gòu)建25個(gè)誘餌載體對(duì)應(yīng)于24個(gè)細(xì)胞周期蛋白,主要集中在細(xì)胞周期動(dòng)力系統(tǒng)(11個(gè))和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)系統(tǒng)(5個(gè))。用其中符合

4、篩選標(biāo)準(zhǔn)的23個(gè)誘餌進(jìn)行Y2H篩選,獲604個(gè)候選獵物陽性克隆,其中336個(gè)獲得測(cè)序結(jié)果。去除非編碼區(qū)和不符合讀框的序列,并去除冗余后,得到101個(gè)蛋白質(zhì)間的90對(duì)相互作用。其中已知相互作用8對(duì),說明的Y2H篩選系統(tǒng)所獲相互作用數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。而大量未知相互作用的發(fā)現(xiàn)提示,在細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中可能還存在很多尚未揭示的調(diào)控機(jī)制。
　　隨后,采用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和生物信息學(xué)方法對(duì)相互作用的可信度進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過對(duì)所得90對(duì)相互作用進(jìn)行酵母回轉(zhuǎn)驗(yàn)證

5、,總體回轉(zhuǎn)陽性率為49％;隨機(jī)挑取回轉(zhuǎn)陽性相互作用中的16對(duì),分別采用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, CoIP)、芯片免疫共沉淀和GST-pull down的方法驗(yàn)證,其中至少在一種方法中驗(yàn)證為陽性的比率是81％,高于已報(bào)道的人類相互作用組中高可信度數(shù)據(jù)的共親和純化實(shí)驗(yàn)的陽性比例(62％)。繼而,采用多種生物信息學(xué)方法對(duì)相互作用的生物學(xué)假陽性進(jìn)行了評(píng)價(jià),包括 PubMed和HPRD(human protein

6、 reference database)中的已知相互作用(literature curated interactions, LCI)、基因敲除表型、基因共表達(dá)、比較基因組學(xué)、GO(gene ontology)功能注釋、相互作用結(jié)構(gòu)域、模式生物同源性比較和網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析等。發(fā)現(xiàn)有16對(duì)(18％,16/90)相互作用的誘餌和獵物的基因名共同出現(xiàn)在PubMed的文獻(xiàn)中,提示它們具有較高的功能相關(guān)性;誘餌和獵物都有基因敲除表型記錄的相互作用對(duì)

7、中,16對(duì)(46％,16/35)相互作用具有相同的基因敲除表型;誘餌和獵物都有GO注釋的58對(duì)相互作用中,共24對(duì)(41％,24/58)相互作用的誘餌和獵物具有相同的亞細(xì)胞定位,17對(duì)(29％,17/58)相互作用的誘餌和獵物具有相同的分子功能,21對(duì)(36％,21/58)相互作用的誘餌和獵物參與相同的生物學(xué)過程;18對(duì)(20％,18/90)相互作用的誘餌和獵物有相互作用結(jié)構(gòu)域存在;10對(duì)(11％,10/90)相互作用可以形成網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)

8、構(gòu)。為從總體上描述相互作用的可信度,參考Stelzl U等人在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)研究中的打分標(biāo)準(zhǔn),整合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和各種生物學(xué)相關(guān)性分析結(jié)果,采用簡(jiǎn)單投票的方式,建立了一個(gè)含有10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的可信度評(píng)分體系。通過評(píng)分,低、中、高可信度的相互作用分別占20％、42％、38％。
　　采用可視化軟件Osprey進(jìn)行了相互作用網(wǎng)絡(luò)繪制和分析,從獲得的相互作用網(wǎng)絡(luò)來看,新獲得的相互作用對(duì)原有網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了有效的補(bǔ)充和拓展。獲得多個(gè)相互作用結(jié)果的細(xì)胞周期

9、蛋白家族新成員:CCNG1和CCNH可能是細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的新的中心蛋白。新的相互作用增強(qiáng)了細(xì)胞周期調(diào)控兩大功能子網(wǎng)絡(luò):Cyclin-CDK-CKI動(dòng)力系統(tǒng)和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)系統(tǒng)內(nèi)部和之間的聯(lián)系,例如:GADD45A-RCHY1-TP53和CCNB1-MAGED1-PLK1,提示二個(gè)子網(wǎng)絡(luò)功能
　　上的密切相關(guān),這些相互作用蛋白可能形成細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中新的功能復(fù)合體。新的相互作用還揭示了細(xì)胞周期檢查點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和NF-κB(nucle

10、ar factorκB)信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的新的交聯(lián),例如:PLK1-TANK,BRCA1-JUP-IKBE等,將兩個(gè)響應(yīng) DNA損傷信號(hào)的下游分支通路聯(lián)系了起來,發(fā)現(xiàn)了二者之間新的功能聯(lián)系。結(jié)合相互作用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果,我們針對(duì)高可信度的相互作用進(jìn)行了深入的文獻(xiàn)挖掘。發(fā)現(xiàn)通過GADD45A與凋亡蛋白Bax相互作用蛋白 SH3GLB1的相互作用,提示了GADD45A誘導(dǎo)凋亡的新的分子機(jī)制;通過CDKN1A與有絲分裂原誘導(dǎo)的GTP酶激活蛋白SIPA

11、1的相互作用提示了SIPA1參與細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控的新的功能角色;PLK1與NF-κB信號(hào)通路接頭蛋白TANK的相互作用介導(dǎo)了細(xì)胞周期和NF-κB信號(hào)通路之間潛在的交聯(lián)。工作為進(jìn)一步的相互作用功能研究提供了重要線索。
　　最后,選取高可信度相互作用—細(xì)胞周期激酶PLK1(polo-like kinase1)與NF-κB信號(hào)通路接頭蛋白TANK(TRAF family member associated NF-κB activator)

12、進(jìn)行了深入的功能研究。細(xì)胞周期調(diào)控激酶參與NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié),是重要生物學(xué)過程細(xì)胞周期和NF-κB信號(hào)通路的新的功能聯(lián)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明支架分子TANK通過募集PLK1與IκB激酶(IκB kinases, IKKs)復(fù)合體的調(diào)控亞基IKKγ即NEMO(NF-κB essential modulator)結(jié)合,并通過抑制NEMO的泛素化來負(fù)調(diào)控NF-κB關(guān)鍵調(diào)控激酶IKKs復(fù)合體的活性。
　　綜上所述,本研究采用酵母雙雜交方法

13、,對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了初步研究,發(fā)現(xiàn)了多個(gè)細(xì)胞周期動(dòng)力系統(tǒng)和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)系統(tǒng)之間的新的分子關(guān)聯(lián),為研究細(xì)胞周期調(diào)控的精細(xì)分子機(jī)制提供了素材。新發(fā)現(xiàn)的多個(gè)相互作用還將細(xì)胞周期檢查點(diǎn)調(diào)控系統(tǒng)和NF-κB信號(hào)通路聯(lián)系了起來,揭示了基本生物學(xué)過程與重要信號(hào)通路之間的功能相關(guān)性。細(xì)胞周期調(diào)控蛋白參與先天免疫相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控是進(jìn)一步功能研究的重要提示。新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期蛋白與凋亡途徑蛋白的相互作用(例如:GADD45A-SH3GLB1),與癌