細胞周期調(diào)控蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡及接頭分子TANK募集細胞周期激酶PLK1抑制NF-κB信號通路的機制研究.pdf

1、細胞周期是生命的基本特征之一,其研究一直是生命科學領(lǐng)域的重點。詳細了解細胞周期的功能、調(diào)控及其它潛在的分子機制,對生物工程及醫(yī)藥開發(fā)領(lǐng)域有巨大的應用價值。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用是生命活動的基礎(chǔ),研究細胞周期調(diào)控蛋白質(zhì)在相互作用中形成的復雜網(wǎng)絡是全面分析和認識細胞周期分子調(diào)控機理的重要手段。開展肝臟中細胞周期相關(guān)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡研究也是中國人類肝臟蛋白質(zhì)組計劃(Chinese human liver proteome project,

2、CNHLPP)之蛋白質(zhì)相互作用連鎖圖研究專題的重要組成部分。
　　本研究采用ProQuestTM酵母雙雜交(yeast two-hybrid,Y2H)系統(tǒng),選擇與細胞周期驅(qū)動和調(diào)控緊密相關(guān)且在肝臟中表達的蛋白質(zhì)作為誘餌,對成人肝臟cDNA文庫進行篩選。細胞周期的驅(qū)動及調(diào)控蛋白主要包括:細胞周期動力系統(tǒng)即細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinase,CDK)和對其進行控制的細胞周期蛋白(cyclin)、細胞

3、周期蛋白依賴性激酶抑制子(cyclin dependent kinase inhibitor,CKI);控制遺傳物質(zhì)復制起始的細胞周期正調(diào)控系統(tǒng)即周期限制點調(diào)控蛋白;保證細胞遺傳物質(zhì)復制和分配質(zhì)量的細胞周期負調(diào)控系統(tǒng)即周期檢查點調(diào)控蛋白;對細胞周期進行質(zhì)量控制的翻譯后修飾酶類和細胞周期相關(guān)生長因子及受體等。我們最終成功構(gòu)建25個誘餌載體對應于24個細胞周期蛋白,主要集中在細胞周期動力系統(tǒng)(11個)和細胞周期檢查點系統(tǒng)(5個)。用其中符合

4、篩選標準的23個誘餌進行Y2H篩選,獲604個候選獵物陽性克隆,其中336個獲得測序結(jié)果。去除非編碼區(qū)和不符合讀框的序列,并去除冗余后,得到101個蛋白質(zhì)間的90對相互作用。其中已知相互作用8對,說明的Y2H篩選系統(tǒng)所獲相互作用數(shù)據(jù)真實可靠。而大量未知相互作用的發(fā)現(xiàn)提示,在細胞周期調(diào)控網(wǎng)絡中可能還存在很多尚未揭示的調(diào)控機制。
　　隨后,采用實驗驗證和生物信息學方法對相互作用的可信度進行評價。通過對所得90對相互作用進行酵母回轉(zhuǎn)驗證

5、,總體回轉(zhuǎn)陽性率為49％;隨機挑取回轉(zhuǎn)陽性相互作用中的16對,分別采用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, CoIP)、芯片免疫共沉淀和GST-pull down的方法驗證,其中至少在一種方法中驗證為陽性的比率是81％,高于已報道的人類相互作用組中高可信度數(shù)據(jù)的共親和純化實驗的陽性比例(62％)。繼而,采用多種生物信息學方法對相互作用的生物學假陽性進行了評價,包括 PubMed和HPRD(human protein

6、 reference database)中的已知相互作用(literature curated interactions, LCI)、基因敲除表型、基因共表達、比較基因組學、GO(gene ontology)功能注釋、相互作用結(jié)構(gòu)域、模式生物同源性比較和網(wǎng)絡拓撲結(jié)構(gòu)分析等。發(fā)現(xiàn)有16對(18％,16/90)相互作用的誘餌和獵物的基因名共同出現(xiàn)在PubMed的文獻中,提示它們具有較高的功能相關(guān)性;誘餌和獵物都有基因敲除表型記錄的相互作用對

7、中,16對(46％,16/35)相互作用具有相同的基因敲除表型;誘餌和獵物都有GO注釋的58對相互作用中,共24對(41％,24/58)相互作用的誘餌和獵物具有相同的亞細胞定位,17對(29％,17/58)相互作用的誘餌和獵物具有相同的分子功能,21對(36％,21/58)相互作用的誘餌和獵物參與相同的生物學過程;18對(20％,18/90)相互作用的誘餌和獵物有相互作用結(jié)構(gòu)域存在;10對(11％,10/90)相互作用可以形成網(wǎng)絡拓撲結(jié)

8、構(gòu)。為從總體上描述相互作用的可信度,參考Stelzl U等人在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡研究中的打分標準,整合實驗數(shù)據(jù)和各種生物學相關(guān)性分析結(jié)果,采用簡單投票的方式,建立了一個含有10個標準的可信度評分體系。通過評分,低、中、高可信度的相互作用分別占20％、42％、38％。
　　采用可視化軟件Osprey進行了相互作用網(wǎng)絡繪制和分析,從獲得的相互作用網(wǎng)絡來看,新獲得的相互作用對原有網(wǎng)絡進行了有效的補充和拓展。獲得多個相互作用結(jié)果的細胞周期

9、蛋白家族新成員:CCNG1和CCNH可能是細胞周期調(diào)控網(wǎng)絡中的新的中心蛋白。新的相互作用增強了細胞周期調(diào)控兩大功能子網(wǎng)絡:Cyclin-CDK-CKI動力系統(tǒng)和細胞周期檢查點系統(tǒng)內(nèi)部和之間的聯(lián)系,例如:GADD45A-RCHY1-TP53和CCNB1-MAGED1-PLK1,提示二個子網(wǎng)絡功能
　　上的密切相關(guān),這些相互作用蛋白可能形成細胞周期調(diào)控網(wǎng)絡中新的功能復合體。新的相互作用還揭示了細胞周期檢查點網(wǎng)絡和NF-κB(nucle

10、ar factorκB)信號通路網(wǎng)絡的新的交聯(lián),例如:PLK1-TANK,BRCA1-JUP-IKBE等,將兩個響應 DNA損傷信號的下游分支通路聯(lián)系了起來,發(fā)現(xiàn)了二者之間新的功能聯(lián)系。結(jié)合相互作用實驗驗證結(jié)果,我們針對高可信度的相互作用進行了深入的文獻挖掘。發(fā)現(xiàn)通過GADD45A與凋亡蛋白Bax相互作用蛋白 SH3GLB1的相互作用,提示了GADD45A誘導凋亡的新的分子機制;通過CDKN1A與有絲分裂原誘導的GTP酶激活蛋白SIPA

11、1的相互作用提示了SIPA1參與細胞周期負調(diào)控的新的功能角色;PLK1與NF-κB信號通路接頭蛋白TANK的相互作用介導了細胞周期和NF-κB信號通路之間潛在的交聯(lián)。工作為進一步的相互作用功能研究提供了重要線索。
　　最后,選取高可信度相互作用—細胞周期激酶PLK1(polo-like kinase1)與NF-κB信號通路接頭蛋白TANK(TRAF family member associated NF-κB activator)

12、進行了深入的功能研究。細胞周期調(diào)控激酶參與NF-κB信號通路的調(diào)節(jié),是重要生物學過程細胞周期和NF-κB信號通路的新的功能聯(lián)系。實驗結(jié)果表明支架分子TANK通過募集PLK1與IκB激酶(IκB kinases, IKKs)復合體的調(diào)控亞基IKKγ即NEMO(NF-κB essential modulator)結(jié)合,并通過抑制NEMO的泛素化來負調(diào)控NF-κB關(guān)鍵調(diào)控激酶IKKs復合體的活性。
　　綜上所述,本研究采用酵母雙雜交方法

13、,對細胞周期調(diào)控網(wǎng)絡進行了初步研究,發(fā)現(xiàn)了多個細胞周期動力系統(tǒng)和細胞周期檢查點系統(tǒng)之間的新的分子關(guān)聯(lián),為研究細胞周期調(diào)控的精細分子機制提供了素材。新發(fā)現(xiàn)的多個相互作用還將細胞周期檢查點調(diào)控系統(tǒng)和NF-κB信號通路聯(lián)系了起來,揭示了基本生物學過程與重要信號通路之間的功能相關(guān)性。細胞周期調(diào)控蛋白參與先天免疫相關(guān)信號通路的調(diào)控是進一步功能研究的重要提示。新發(fā)現(xiàn)的細胞周期蛋白與凋亡途徑蛋白的相互作用(例如:GADD45A-SH3GLB1),與癌