絲-蘇氨酸蛋白激酶Plk1在小鼠胚胎干細(xì)胞中調(diào)控通路的研究.pdf

1、絲/蘇氨酸蛋白激酶Polo-like kinase 1(Plk1)是一類從酵母到人類都高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族中的一員。目前已經(jīng)證實(shí)絲/蘇氨酸蛋白激酶Plk1(Polo-like kinase 1)與不同的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的精密調(diào)控有關(guān)，從而確保了細(xì)胞周期事件(如DNA修復(fù)、雙極紡錘體的形成、染色體的分離及有絲分裂的退出)按照嚴(yán)格的時(shí)間和順序正常進(jìn)行。Plk1的高度表達(dá)和腫瘤患者的低存活率之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著的相關(guān)性，提示P

2、lk1在某些腫瘤類型中可以作為負(fù)性預(yù)后指標(biāo)。盡管目前已有不少研究Plk1的報(bào)道，但Plk1調(diào)控細(xì)胞周期及在腫瘤中發(fā)揮作用的分子機(jī)制并不十分清楚，因此尋找細(xì)胞內(nèi)與Plk1相互作用的分子，為闡明Plk1調(diào)控細(xì)胞周期的機(jī)制及腫瘤等疾病的防治打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)就顯得十分必要。 本論文旨在使用酵母雙雜交技術(shù)探尋與Plk1相互作用的蛋白質(zhì)，為深入研究和理解Plk1在細(xì)胞中的功能和地位奠定基礎(chǔ)。我們選擇了實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的小鼠胚胎干細(xì)胞cDNA文庫(kù)作為

3、基礎(chǔ)，首先利用RT-PCR方法獲得了小鼠Plk1基因。通過利用酵母雙雜交方法，以小鼠全長(zhǎng)Plk1作為誘餌蛋白篩選小鼠胚胎干細(xì)胞cDNA文庫(kù)中與其相互作用的蛋白，獲得了DDX39(DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)box polypeptide 39)、BAT1A(HLA-B-associated transcript 1A)、NACl(nucleus accumbens-1)、BicD2(bicaudal D homolog 2

4、)、MLL3(myeloid/lymphoid ormixed-lineage leukemia 3)等幾個(gè)候選蛋白，其中NACl、MLL3與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)，DDX39、BAT1A與mRNA前體的剪切、加工及mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)緊密相關(guān)，而BicD2與高爾基體的調(diào)控緊密相關(guān)，提示我們Plk1與基因轉(zhuǎn)錄、mRNA前體的剪切、加工、mRNA的運(yùn)輸及胞質(zhì)分裂中高爾基體的調(diào)控有關(guān)。進(jìn)而通過激光共定位，免疫共沉淀、GST-pulldo

5、wn等方法證實(shí)Plk1與DDX39、BAT1A、NACl分別存在直接相互作用，并通過構(gòu)建缺失體對(duì)DDX39、BAT1A、NACl與Plk1相結(jié)合的區(qū)域進(jìn)行了驗(yàn)證，為進(jìn)一步研究Plk1與DDX39、BAT1A、NACl相互作用的生理意義奠定了基礎(chǔ)；體外磷酸化實(shí)驗(yàn)表明，Plk1可以使DDX39、BAT1A、NACl發(fā)生磷酸化，這為Plk1參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、mRNA前體的剪切、加工、mRNA的運(yùn)輸提供了更為直接的證據(jù)。Plk1 konckdo