Spindlin1和Aurora-A激酶相互作用的研究.pdf

1、惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人們健康生活的疾病,死亡率居高不下,尋求新的腫瘤相關(guān)基因,具有重要的理論與社會(huì)意義。在早期研究中,我們對人卵巢癌相關(guān)基因進(jìn)行了篩選和研究,克隆、鑒定并命名了人Spindlin1基因,該基因與小鼠spindlin基因高度同源,同屬于Spin/Ssty基因家族。Spin/Ssty基因家族被證實(shí)參與配子發(fā)生過程,并在早期胚胎中檢測到其表達(dá)。在進(jìn)一步的研究中,我們發(fā)現(xiàn)Spindlin1定位于細(xì)胞核,過表達(dá)Spindlin1的N

2、IH3T3細(xì)胞不僅具有明顯的克隆形成和遷移能力,并且能使裸鼠成瘤。之后,我們又證明過表達(dá)Spindlin1會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)多核,G2/M期細(xì)胞阻滯,紡錘體組裝異常,有絲分裂災(zāi)變及基因組不穩(wěn)定等現(xiàn)象。以上研究結(jié)果提示我們:Spindlin1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。但是,對于Spindlin1發(fā)揮其生物學(xué)作用的分子機(jī)制仍尚未明了。
　　Aurora-A激酶屬于Ser/Thr激酶,是Aurora激酶家族的重要成員,該激酶家族主要在

3、中心體成熟分離和胞質(zhì)分裂過程中扮演重要角色。目前已報(bào)道Aurora-A激酶在多種類型腫瘤細(xì)胞中具有高水平表達(dá),并且在50％以上的卵巢癌和乳腺癌中發(fā)現(xiàn)Aurora-A激酶的表達(dá)水平明顯上升,并伴隨其激酶活性的增強(qiáng)。Aurora-A激酶表達(dá)異常會(huì)破壞細(xì)胞周期多個(gè)檢測點(diǎn)功能,導(dǎo)致紡錘體組織異常及胞質(zhì)分離異常,最終形成非整倍體細(xì)胞,與腫瘤發(fā)生過程密切相關(guān)。Aurora-A激酶參與多種腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控,近年來對Aurora-A激酶及其作用底

4、物在腫瘤發(fā)生中的作用機(jī)制已成為研究熱點(diǎn),但關(guān)于Aurora-A激酶調(diào)控的下游分子更為詳細(xì)的作用機(jī)制仍有許多不為人知。對其新的作用底物不斷研究發(fā)現(xiàn)的過程,為我們研究腫瘤藥物靶向分子提供了新的思路。
　　我們的前期研究發(fā)現(xiàn),Spindlin1表達(dá)異常時(shí)與Aurora-A激酶過度表達(dá)產(chǎn)生的細(xì)胞有絲分裂期阻滯,紡錘體組織紊亂,多核等諸多現(xiàn)象存在相似之處,除此之外兩者在有絲分裂期亞細(xì)胞定位上也有類似的紡錘體分布定位,這些信息提示我們二者在時(shí)

5、空上存在相互作用的可能性。此外,我們之前在對Spindlin1的三維晶體結(jié)構(gòu)研究中,發(fā)現(xiàn)Spindlin1的結(jié)構(gòu)分為三個(gè)序列上非常類似的重復(fù)結(jié)構(gòu)域,存在磷酸根配體的結(jié)合位點(diǎn),意味著磷酸化修飾可能對Spindlin1發(fā)揮生物學(xué)功能起著重要作用。以上現(xiàn)象使我們有理由推測:Spindlin1可能是Aurora-A激酶新的作用底物,受到其作用而發(fā)生磷酸化修飾變化;Aurora-A激酶的磷酸化作用有可能對Spindlin1生物學(xué)功能的發(fā)揮產(chǎn)生重要

6、作用。
　　為了驗(yàn)證我們的假設(shè),在本課題中我們進(jìn)一步明確Spindlin1的生物學(xué)功能,并在此基礎(chǔ)上展開Spindlin1與Aurora-A激酶相互作用的研究。
　　首先,為研究Spindlin1對腫瘤細(xì)胞增殖的影響,我們利用慢病毒包裝系統(tǒng)篩選出穩(wěn)定外源表達(dá)Spindlin1的幾株單克隆腫瘤細(xì)胞株,用克隆形成、CCK-8及裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)從體外和體內(nèi)水平證明了Spindlin1能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖能力。其中Spindlin1能夠

7、使腫瘤細(xì)胞的克隆形成能力增至1.7-3.1倍,并導(dǎo)致裸鼠成瘤的質(zhì)量增長至2.4倍。同時(shí),我們將合成的小分子干擾RNA(siRNA)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞中,降低內(nèi)源性Spindlin1的表達(dá),進(jìn)行克隆形成和CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),證明Spindlin1表達(dá)量降低之后,腫瘤細(xì)胞的生長速度也受到抑制,克隆形成能力降低46%。其次,在利用Millicell進(jìn)行的體外侵襲實(shí)驗(yàn)中,我們證明了Spindlin1過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲能力增至3倍。最

8、后,我們用Hoechst33258對細(xì)胞核進(jìn)行染色,統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞比例,證明了過表達(dá)Spindlin1會(huì)少量促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,但作用并不十分顯著。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了Spindlin1的癌基因特性。
　　然后,我們對Spindlin1與Aurora-A激酶之間的相互作用進(jìn)行了驗(yàn)證。我們先通過免疫熒光染色,觀察到Spindlin1和Aurora-A激酶在細(xì)胞有絲分裂間期定位于中心體,在有絲分裂前期到末期定位于紡錘體兩極,證明Spindl

9、in1和Aurora-A激酶存在有絲分裂亞細(xì)胞共定位。隨后我們通過GST-Pulldown實(shí)驗(yàn)和Co-IP實(shí)驗(yàn)分別從體外和體內(nèi)證明Spindlin1與Aurora-A激酶存在直接的相互作用。接著我們用體外激酶實(shí)驗(yàn)證明Spindlin1能夠被Aurora-A激酶磷酸化,并進(jìn)一步通過構(gòu)建Spindlin1截短體和突變體進(jìn)行體外激酶實(shí)驗(yàn),證明Aurora-A激酶磷酸化Spindlin1Ser84位和Ser99位。最后,為觀察Spindlin1

10、磷酸化位點(diǎn)對其生物學(xué)功能的影響,我們構(gòu)建了Spindlin1Ser84/99Ala聯(lián)合突變體,進(jìn)行克隆形成、CCK-8和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn),證明了Spindlin1磷酸化位點(diǎn)突變會(huì)降低其對腫瘤細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用,即磷酸化位點(diǎn)修飾變化與Spindlin1的生物學(xué)功能相關(guān)。其中磷酸化位點(diǎn)突變使腫瘤細(xì)胞的克隆形成能力降低43%,并導(dǎo)致裸鼠成瘤的質(zhì)量降低69%。以上結(jié)果證明:Spindlin1是Aurora-A激酶新的作用底物,磷酸化位點(diǎn)是Ser84

11、和Ser99位,這兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化對于Spindlin1維持其生物學(xué)功能是不可或缺的。
　　在確認(rèn)Spindlin1是Aurora-A激酶新的作用底物,并驗(yàn)證Spindlin1磷酸化位點(diǎn)對維持其功能的作用之后,我們開始思考被Aurora-A激酶磷酸化的Spindlin1是通過何種途徑發(fā)揮其對腫瘤生長的促進(jìn)作用呢?前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)表明Spindlin1可能與在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用的Wnt/TCF-4信號(hào)通路相關(guān),因此在本部分實(shí)

12、驗(yàn)中我們以TCF-4為切入點(diǎn)展開對Spindlin1作用機(jī)制的研究。首先我們用GST-Pulldown證明了Spindlin1與TCF-4在體外存在直接相互作用,之后又利用TCF/β-catenin報(bào)告載體——pTOPFlash,通過雙熒光素酶檢測系統(tǒng)證明Spindlin1能夠促進(jìn)Wnt/TCF-4通路活性1.6-3.6倍。另外我們還選取了對細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期具有調(diào)控作用的Wnt/TCF-4信號(hào)通路的下游信號(hào)分子c-Myc和Cyclin

13、D1作為研究對象,通過RT-PCR和Westernblot的方法證明Spindlin1的過表達(dá)會(huì)促進(jìn)這些信號(hào)分子在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá),這些結(jié)果表明Spindlin1可能通過Wnt/TCF-4信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證Spindlin1對Wnt/TCF-4信號(hào)通路的促進(jìn)作用與其磷酸化位點(diǎn)的關(guān)系,我們用穩(wěn)定表達(dá)Spindlin1Ser84/99Ala聯(lián)合突變體的腫瘤細(xì)胞重復(fù)以上Spindlin1對Wnt/TCF-4信號(hào)通

14、路作用的實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn),Spindlin1突變體與TCF-4直接相互作用減弱,對Wnt/TCF-4通路活性無促進(jìn)作用,并且導(dǎo)致Spindlin1對信號(hào)通路下游信號(hào)分子表達(dá)的促進(jìn)作用也大大降低。以上結(jié)果證明:Spindlin1促進(jìn)Wnt/TCF-4信號(hào)通路活性,其磷酸化位點(diǎn)在此過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。
　　綜上所述,Spindlin1對腫瘤細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用,它是Aurora-A激酶新的作用底物,Aurora-A激酶磷酸化Spind