柘木黃酮類化學(xué)成分及抗腫瘤活性研究.pdf

1、目的：
　　 1.文獻(xiàn)報(bào)道柘木的黃酮類成分具有抗癌活性，因此本文對(duì)可能存在黃酮類成分的柘木藥材乙醇干膏的乙酸乙酯和正丁醇萃取部分進(jìn)行提取、分離，并鑒定化學(xué)成分，為柘木活性成分研究提供參考。
　　 2.由于柘木總黃酮和總多糖提取工藝研究未見報(bào)道，因此本文對(duì)柘木藥材中總黃酮和總多糖的提取工藝進(jìn)行考察并測(cè)定含量，為柘木藥材的開發(fā)利用提供科學(xué)參考；環(huán)桂木黃素體外抗腫瘤活性明顯，HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地柘木中環(huán)桂木黃素含量，為柘木藥材

2、的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供新的參考。
　　 3.由于柘木在臨床治療食道癌方面有比較好的療效，因此本文通過對(duì)柘木藥材總黃酮和總多糖的體外藥理活性篩選，考察其對(duì)不同癌細(xì)胞的抗癌活性，為進(jìn)一步擴(kuò)大柘木藥材的應(yīng)用范圍和探討其抗癌機(jī)理提供參考。
　　 4.本文通過大孔樹脂分離純化柘木藥材中總黃酮，研究其純化工藝，為柘木藥材的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)參考
　　 材料與方法：
　　 1.材料與試劑
　　 柘木：桑科植物柘樹C

3、udrania tricuspidata（Carr.）Bur.的干燥根及藤莖。實(shí)驗(yàn)材料采自廣西南寧市郊外，由廣西中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定教研室廖月葵老師提供并鑒定，各商品藥材購(gòu)自廣西各地和安國(guó)藥材市場(chǎng)。
　　 2.方法
　　 （1）通過硅膠柱層析，凝膠柱層析，重結(jié)晶等分離純化手段，從柘木干膏的乙酸乙酯和正丁醇萃取部分里分離、純化單體化合物。
　　 （2）通過單因素考察、正交試驗(yàn)確定柘木總黃酮和總多糖的最佳提取工藝；HPL

4、C法測(cè)定不同產(chǎn)地柘木藥材中環(huán)桂木黃素的含量。
　　 （3）采用MTT還原法，篩選柘木總黃酮類和總多糖類的體外抗腫瘤活性（人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人肺腺癌A549細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞、人胃癌SGC7901細(xì)胞）。
　　 （4）利用靜態(tài)吸附方法篩選柘木總黃酮的最適大孔樹脂，利用動(dòng)態(tài)吸附方法研究最適大孔樹脂分離柘木總黃酮的條件。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過對(duì)柘木黃酮類化合物的研究，從乙酸乙酯和正丁醇部分分

5、離鑒定了7個(gè)單體化合物，分別為：①二氫桑色素、②胡蘿卜苷、③5，7，4'-三羥基二氫異黃酮、④山柰酚、⑤槲皮素、⑥β-谷甾醇，⑦環(huán)桂木黃素。
　　 2.經(jīng)過單因素考察、正交試驗(yàn)結(jié)果，柘木總黃酮的最佳提取工藝為:12倍量60％乙醇提取3次，每次1.5 h，平均浸膏得率為6.68％，平均總黃酮含量為1.92％，RSD<3％（n=3）；總多糖的最佳提取工藝為：藥材去色素干燥后，10倍提取溶媒，提取溫度為90℃，提取時(shí)間為3 h，平均總

6、多糖含量為1.89 mg·g-1，RSD<3％（n=3）；HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地柘木藥材中環(huán)桂木黃素的含量，色譜條件為：色譜柱為Aglinet C18（150×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1％磷酸水溶液，梯度洗脫；流速為1 mL·min-1；柱溫為25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm。測(cè)得廣西靈山縣產(chǎn)的柘木中環(huán)桂木黃素含量最高，為3.45 mg·g-1。
　　 3.通過MTT還原法實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，柘木總黃酮對(duì)癌細(xì)胞均有不同程度

7、的抑制作用，對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用為：HeLa細(xì)胞>A549細(xì)胞>SGC-7901細(xì)胞>HepG2細(xì)胞。柘木總多糖對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用：SGC-7901細(xì)胞>HeLa細(xì)胞>HepG2細(xì)胞>A549細(xì)胞。
　　 4.通過靜態(tài)吸附與解析實(shí)驗(yàn)，篩選了5種大孔樹脂，確定用AB-8型大孔樹脂來純化柘木總黃酮，該樹脂的最佳條件為：以1.5mL·min-1的流速上樣后，用5倍量上柱樹脂體積的75％乙醇的洗脫。
　　 結(jié)論：
　　 1

8、.文獻(xiàn)報(bào)道柘木黃酮類成分為其抗癌的活性成分，因此本文從柘木的化合物分離入手，得到了7個(gè)單體化合物，分別為：二氫桑色素、胡蘿卜苷、5，7，4'-三羥基二氫異黃酮、山柰酚、槲皮素、β-谷甾醇、環(huán)桂木黃素。其中二氫桑色素、5，7，4'-三羥基二氫異黃酮、山柰酚、槲皮素，環(huán)桂木黃素為黃酮類化合物。
　　 2.首次對(duì)總黃酮和總多糖的提取工藝進(jìn)行考察，最佳提取工藝條件穩(wěn)定可行，可為柘木開發(fā)利用提供科學(xué)參考。首次采用HPLC測(cè)量不同產(chǎn)地柘木藥

9、材中環(huán)桂木黃素的含量，該法操作簡(jiǎn)便、快捷、靈敏度高，可為柘木藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供新的指標(biāo)和方法。
　　 3.通過MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人肺腺癌A549細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞、人胃癌SGC7901細(xì)胞在總黃酮和總多糖作用下與未加藥物的陰性對(duì)照組相比均有不同程度的增長(zhǎng)抑制現(xiàn)象，濃度越大抑制作用越強(qiáng)，多糖的抑制效果不如黃酮。
　　 4.本文篩選了適合柘木黃酮純化的大孔樹脂型號(hào)及純化條件，為工業(yè)化生產(chǎn)得到更高純