維甲酸誘導(dǎo)脊膜膨出胎鼠神經(jīng)損害的觀察和手術(shù)修補(bǔ)實(shí)驗(yàn).pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、脊髓脊膜膨出等神經(jīng)管缺陷是導(dǎo)致小兒神經(jīng)原性膀胱功能障礙的最主要的病因,可致截癱、大小便失禁、腦積水、性功能障礙、骨骼畸形和精神損害等嚴(yán)重后果。胎兒外科手術(shù)可能是早期干預(yù)脊髓脊膜膨出的較好方法,但對(duì)于手術(shù)效果等還有待利用動(dòng)物模型等進(jìn)一步的研究;另外,脊髓脊膜膨出后脊髓損傷,導(dǎo)致膀胱神經(jīng)和肌肉的改變,其相關(guān)神經(jīng)損害及相互關(guān)系目前還未完全明確,需要進(jìn)一步的研究。以往的脊髓脊膜膨出動(dòng)物模型多為手術(shù)造?;蚧蛲蛔兿祫?dòng)物,與人類(lèi)的脊髓脊膜膨出的病理

2、生理過(guò)程有較大的差異。維甲酸誘導(dǎo)SD孕鼠,產(chǎn)生脊髓脊膜膨出胎鼠,可能是一個(gè)較理想的動(dòng)物模型。
   目的:本研究?jī)?yōu)化維甲酸灌喂孕SD大鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生脊髓脊膜膨出胎鼠的動(dòng)物模型,以得到較高的胎鼠脊髓脊膜膨出比率和較低的死胎比率,同時(shí)希望脊髓脊膜膨出胎鼠膨出范圍較小。在此基礎(chǔ)上通過(guò)對(duì)不同胚胎期MMC胎鼠膀胱平滑肌的發(fā)育和神經(jīng)支配情況及脊髓神經(jīng)損害的形態(tài)學(xué)觀察,并且對(duì)一些脊髓損傷相關(guān)的細(xì)胞因子的mRNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),以期了解這種損

3、害的時(shí)間和空間上的變化及其相互關(guān)系。同時(shí)利用這一模型,采用組織工程材料對(duì)胎鼠進(jìn)行脊膜膨出修補(bǔ)實(shí)驗(yàn),以探索胎內(nèi)手術(shù)方法并了解胎內(nèi)手術(shù)對(duì)改善膀胱神經(jīng)支配可能的作用。
   材料與方法:
   1、維甲酸誘導(dǎo)脊髓脊膜膨出胎鼠動(dòng)物模型的優(yōu)化:按孕鼠灌喂時(shí)間分為3組:孕9天組(孕9天9a.m.左右灌喂維甲酸),孕9.5天組(孕9天晚11p.m。左右灌喂維甲酸),孕10天組(孕10天9a.m.左右灌喂維甲酸)。實(shí)驗(yàn)組:SD孕鼠灌喂全

4、反式維甲酸,溶于2ml橄欖油中;對(duì)照組:SD孕鼠僅灌喂2ml橄欖油。灌喂劑量:孕9天組劑量從60-110mg/kg不等,分為若干小組;孕10天組劑量從40-120mg/kg不等,分為若干小組;孕9.5天組劑量分為80和100mg/kg兩個(gè)小組。在胚胎16,18,20天(E16,E18,E20)分別剖腹產(chǎn)取出胎鼠,統(tǒng)計(jì)總孕鼠數(shù)、總胎鼠數(shù)、MMC胎鼠數(shù)、死胎/吸收胎數(shù)等數(shù)據(jù)。對(duì)實(shí)驗(yàn)組,計(jì)算MMC率(MMC胎鼠占所有胎鼠的比率)、死胎率(死胎

5、/吸收胎占所有胎鼠的比率)和活胎MMC率(MMC胎鼠占所有活胎的比率),數(shù)據(jù)用Stata7軟件進(jìn)行Pearsonx2檢驗(yàn),以P≤0.05為有顯著性差異。
   2、不同胎齡脊髓脊膜膨出胎鼠膀胱和脊髓神經(jīng)損害的形態(tài)學(xué)觀察:胎鼠分為MMC組(灌喂維甲酸后產(chǎn)生MMC的胎鼠)和正常對(duì)照組(灌喂橄欖油后產(chǎn)生的正常胎鼠),每組再根據(jù)胎齡各分3小組,即胚胎16天組(E16),胚胎18天組(E18),胚胎20天組(E20),共6小組。取各組腰骶

6、段脊髓切片,用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)脊髓的GFAP、VAChT的表達(dá);取各組膀胱切片,檢測(cè)α-Actin和neurotubulin-β-Ⅲ的表達(dá);另取各組腰骶段脊髓及膀胱切片,作HE染色。Leica Qwin軟件拍攝顯微鏡下照片,Image-Pro Plus5.1軟件分析免疫組化照片相關(guān)部分的光密度,SPSS16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以P≤0.05為有顯著性差異。
   3、不同胎齡脊髓脊膜膨出胎鼠脊髓HGF等細(xì)胞因子的R

7、T-PCR檢測(cè):胎鼠分為MMC組(灌喂維甲酸后產(chǎn)生MMC的胎鼠)和正常對(duì)照組(灌喂橄欖油后產(chǎn)生的正常胎鼠),每組再根據(jù)胎齡各分3小組,即胚胎18天組(E18),胚胎20天組(E20),胚胎21天組(E21),共6小組,每組胎鼠數(shù)量為5個(gè)。解剖顯微鏡下分離胎鼠標(biāo)本脊柱,顯微鑷子拆除背側(cè)脊椎,完整取出包括膨出部分的整根脊髓。立即抽提RNA,對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)及受體c-MET和纖溶酶原激活物tPA和uPA以及內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行反轉(zhuǎn)

8、錄和PCR擴(kuò)增。獲得的數(shù)據(jù)采用PSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,對(duì)分組資料(對(duì)照組和MMC組)采用power(2,-△ct)處理數(shù)據(jù);多組間比較進(jìn)行ANOVA檢驗(yàn)分析,兩組間檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)(以P值≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。
   4、組織工程材料大鼠胎仔手術(shù)修補(bǔ)脊膜膨出:孕18天MMC大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉,剖腹切開(kāi)子宮,暴露胎鼠脊膜膨出部位,采用殼聚糖-明膠薄膜以氰基丙烯酸酯粘合劑粘合于脊膜膨出部位,修補(bǔ)脊膜膨出?;丶{胎鼠,

9、修補(bǔ)子宮,關(guān)閉腹腔切口。孕鼠養(yǎng)至孕21天剖宮取出胎鼠。觀察殼聚糖-明膠薄膜覆蓋情況;取出脊髓連續(xù)切片,HE染色;膀胱免疫組化染色,與正常組對(duì)照,觀測(cè)VACHT和neurotubulin-β-Ⅲ的表達(dá),檢測(cè)光密度并行t檢驗(yàn)。
   結(jié)果:
   1、維甲酸誘導(dǎo)脊髓脊膜膨出胎鼠動(dòng)物模型的優(yōu)化:1.孕9天日間灌喂組按維甲酸灌喂劑量分為60、70、80和110mg/kg4個(gè)小組,共18只孕鼠,209只胎鼠。各劑量組所得到的MMC

10、胎鼠率都非常低(0-1.92%),死胎率卻非常高(90.91%-100%)。2.孕10天灌喂組按維甲酸灌喂劑量分為40、50、60、70、80、85、90、100和120rag/kg9個(gè)小組,共56只孕鼠,564只胎鼠。劑量為120mg/kg時(shí),胎鼠MMC率最高,為29.95%,活胎MMC率也最高,為38.99%,而死胎率相對(duì)較低(23.19%)。3.孕9.5天灌喂組按維甲酸灌喂劑量分為80和100mg/kg2個(gè)小組,共41只孕鼠,42

11、3只胎鼠。兩組MMC率分別為31.66%和29.41%,沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;活胎MMC率分別為44.21%和55.56%,也沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而死胎率80mg/kg組為28.40%,顯著低于100mg/kg組的47.06%(P=0.001)。此外,在80mg/kg組,有一些MMC膨出的范圍較小的胎鼠。
   2、不同胎齡脊髓脊膜膨出胎鼠膀胱和脊髓神經(jīng)損害的形態(tài)學(xué)觀察:1.在胚胎16天,2組胎鼠的膀胱肌層內(nèi)就已經(jīng)可以檢測(cè)出neumtub

12、ulin-β-Ⅲ的表達(dá);胚胎16、18和20天時(shí),MMC組胎鼠膀胱內(nèi)的neurotubulin-β-Ⅲ表達(dá)較相同胚胎期的正常對(duì)照組顯著降低。2.在胚胎16、18、20天,2組的膀胱肌層內(nèi)都能看到較多的α-Actin的陽(yáng)性顯色;且各胚胎期,2組膀胱內(nèi)的(α-Actin表達(dá)無(wú)顯著性差異。3.在胚胎16天和18天,正常組和MMC組及胚胎20天正常組的脊髓內(nèi),GFAP染色均很少,沒(méi)有明顯的星形膠質(zhì)細(xì)胞顯示,在胚胎20天的MMC組胎鼠的脊髓背側(cè),

13、可見(jiàn)大量的GFAP陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞顯影,其表達(dá)顯著高于正常組。4.MMC組各個(gè)胚胎期脊髓VAChT的表達(dá)都較少,在胚胎20天組的背外側(cè)核僅見(jiàn)少量陽(yáng)性表達(dá)的神經(jīng)元;而正常組VAChT的表達(dá)相對(duì)較多,在胚胎20天組的背外側(cè)核可見(jiàn)較多陽(yáng)性表達(dá)的神經(jīng)元;2組間各胚胎期VAChT表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
   3、不同胎齡脊髓脊膜膨出胎鼠脊髓HGF等細(xì)胞因子的RT-PCR檢測(cè):1.c-M盯在MMC組較對(duì)照組隨胚胎時(shí)間增加其表達(dá)有增高趨勢(shì)

14、,在胚胎21天MMC組較對(duì)照組表達(dá)升高比18天差異有顯著性。2.c-MET的配體HGF的表達(dá)MMC組也隨胚胎時(shí)間增加有增高趨勢(shì),在胚胎21天MMC組較對(duì)照組表達(dá)升高比18和20天差異均有顯著性。3.tPA對(duì)照組和MMC組表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但MMC組均高于對(duì)照組。4.uPA在MMC組較對(duì)照組隨胚胎時(shí)間增加其表達(dá)有增高趨勢(shì),在E21天MMC組較對(duì)照組表達(dá)升高比E18和E20組差異均有顯著性。
   4、組織工程材料大鼠胎仔手術(shù)修補(bǔ)脊

15、膜膨出:1-共進(jìn)行孕鼠手術(shù)85只,麻醉死亡孕鼠10只,成功誘導(dǎo)出脊髓脊膜膨出的孕鼠31只。每只孕鼠僅取1個(gè)胎鼠手術(shù),20只胎鼠順利完成手術(shù)修補(bǔ)操作過(guò)程,11只手術(shù)失敗主要為胎鼠溢出子宮,胎盤(pán)剝離。20只行脊膜膨出修補(bǔ)手術(shù)完成的胎鼠中7只存活但2只殼聚糖-明膠薄膜脫落。5只修補(bǔ)成功,成功率15.1%(占手術(shù)修補(bǔ)的31只比例)。另13只死亡,死亡率65%。修補(bǔ)脊髓脊膜膨出的胎鼠在孕21天HE染色可以觀察到殼聚糖-明膠薄膜下有皮膚樣細(xì)胞長(zhǎng)入。

16、膀胱免疫組化染色顯示neurotubulin-β-Ⅲ表達(dá)手術(shù)組與正常對(duì)照組無(wú)差異,與MMC組比較差異有顯著性;VACHT檢測(cè),脊膜膨出修補(bǔ)組與MMC組比較差異無(wú)顯著性。
   結(jié)論:
   1、在本實(shí)驗(yàn)室,孕10天120mg/kg灌喂組、孕9.5天80mg/kg和孕9.5天100mg/kg灌喂組均能取得約30%的MMC率,死胎率前兩者顯著低于后者。孕9.5天80mg/kg灌喂組制模所得胎鼠伴發(fā)其他嚴(yán)重畸形相對(duì)較少,與臨床

17、病例表現(xiàn)更為接近,可能更適合用于胎兒外科等研究,是較為理想的制模條件。
   2、MMC胎鼠胚胎16天至20天膀胱肌層內(nèi)可見(jiàn)神經(jīng)支配,但神經(jīng)纖維減少,這與脊髓內(nèi)骶副交感神經(jīng)核和背外側(cè)核的膽堿能神經(jīng)元減少是同步的,這兩個(gè)區(qū)域分別是支配膀胱逼尿肌的盆神經(jīng)和支配尿道外括約肌陰部神經(jīng)的節(jié)前神經(jīng)元分布的區(qū)域。MMC胎鼠膀胱平滑肌的分化和發(fā)育與正常組相比無(wú)顯著差別。
   3、MMC胎鼠脊髓損傷后的神經(jīng)修復(fù)過(guò)程,星形膠質(zhì)細(xì)胞的出現(xiàn)晚

18、于胚胎18天;在胚胎20天,脊髓的背側(cè)(即MMC突起于羊膜腔的一側(cè))出現(xiàn)大量的星形膠質(zhì)細(xì)胞。
   4、MMC胎鼠脊髓的HGF及其受體c-MET的RT-PCR檢測(cè)提示,HGF及c-MET的表達(dá)在胚胎晚期(E21)比早期(E18天),MMC組較對(duì)照組表達(dá)升高的差異有顯著性。這一結(jié)果提示HGF和c-MET的表達(dá)在MMC組隨胚胎時(shí)間增加有增高趨勢(shì)。
   5、MMC胎鼠脊髓的tPA及uPA的RT-PCR檢測(cè)提示,uPA的表達(dá)在

19、胚胎晚期(E21)比早期(E18天,E20),MMC組較對(duì)照組表達(dá)升高的差異有顯著性,而tPA的表達(dá)兩組無(wú)明顯差異。這一結(jié)果提示uPA的表達(dá)在MMC組隨胚胎時(shí)間增加有增高趨勢(shì)。
   6、胎鼠脊髓脊膜膨出可以采用組織工程材料殼聚糖一明膠薄膜在胎內(nèi)進(jìn)行修補(bǔ)。孕18天修補(bǔ)脊髓脊膜膨出的胎鼠在孕21天HE染色可以觀察到殼聚糖-明膠薄膜下有皮膚樣細(xì)胞長(zhǎng)入。膀胱免疫組化染色顯示neurotubulin-β-Ⅲ表達(dá),手術(shù)組與正常對(duì)照組無(wú)差異

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