應(yīng)用維甲酸體外誘導(dǎo)胎鼠脊柱裂畸形及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞羊膜腔內(nèi)注射治療潛能的研究.pdf

1、目的:
　　神經(jīng)管畸形(Neural tube defects，NTDs)是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)先天性畸形之一，與神經(jīng)元的發(fā)育異常有關(guān)。脊柱裂(spina bifida)是神經(jīng)管畸形中較常見的一種。我們前期的研究結(jié)果表明NTDs的臨床表現(xiàn)可能由感覺、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目減少導(dǎo)致，而且，在晚期胚胎階段，大鼠脊柱裂胚胎的神經(jīng)細(xì)胞死亡增加。研究NTDs的發(fā)生機(jī)制及移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Strom

2、alCells，MSCs)對(duì)其修復(fù)作用，為神經(jīng)管畸形的早期診治提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)
　　從GFP-Wistar鼠的股骨中沖洗出骨髓，制作骨髓細(xì)胞懸液，后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中（含5％CO2）培養(yǎng)。首次48小時(shí)后換液，后常規(guī)換液，一周后細(xì)胞80％融合，0.25％胰酶消化傳代。傳3-5代后大部分細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　2、大鼠胚胎體外培養(yǎng)及維甲酸致畸<

3、br>　　孕鼠E10時(shí)剖腹取胎，保留完整卵黃囊和胎盤。利用全胚胎培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行體外培養(yǎng)，維甲酸用DMSO（Dimethyl sulfoxide二甲基亞楓）溶解，胚胎隨機(jī)分為正常對(duì)照組、3μM維甲酸處理組，分別置于大鼠即刻離心血清(ICS，Immediatelycentrifugal serum)中，在37℃恒溫孵箱中旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速35rpm。
　　3、體外羊膜腔內(nèi)注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
　　培養(yǎng)24小時(shí)后，棄掉維甲酸，兩組胚胎進(jìn)

4、行羊膜腔內(nèi)MSCs顯微注射，按照是否注射MSCs將胚胎分為無注射組(no injection)、單純培養(yǎng)基注射組(blankinjection)、MSCs注組(Control-MSCs injection)三組。無注射組，不進(jìn)行任何操作。單純培養(yǎng)基注射組，在羊膜腔注射0.2μl（2000-3000個(gè)/μl）細(xì)胞培養(yǎng)基。MSCs注射組，在羊膜腔內(nèi)注射0.2μl GFP-MSCs懸液。
　　4、Real-time PCR
　　檢

5、測(cè)正常組和畸形組Igta1-mRNA的表達(dá)。
　　5、冰凍切片制作及免疫熒光染色
　　取出胚胎→加適量冰凍切片包埋劑(OCT)放入小盒內(nèi)→放入液氮10-20s→-80℃冰箱保存或恒冷切片機(jī)冰凍切片→免疫熒光染色。
　　結(jié)果:
　　利用維甲酸體外致畸成功誘導(dǎo)出大鼠胚胎出現(xiàn)顱腦畸形、脊柱裂等神經(jīng)管畸形。atRA致畸組胚胎生長發(fā)育情況較與正常對(duì)照組相比明顯滯后。體外羊膜腔內(nèi)注射MSC，MSC可存活于正常胚胎和神經(jīng)管畸形

6、胚胎的神經(jīng)管內(nèi)。神經(jīng)管畸形組胚胎體內(nèi)存活的MSCs數(shù)較正常對(duì)照組高，體式熒光顯微鏡下可見在神經(jīng)管畸形部位有大量MSCs附著并存活。神經(jīng)管畸形發(fā)生部位對(duì)移植的MSCs有明顯的趨化作用，胚胎的其他部位少見MSCs細(xì)胞的存活。神經(jīng)管畸形（顱腦段）組Itga1-mRNA的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)與整合素α1(Itga1)的表達(dá)存在同步化，即可能Itga1在MSCs的特異性趨化作用中起了一定的作用，在