RNAi沉默survivin基因?qū)CCB的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、本文就RNAi沉默survivin基因?qū)CCB的影響及其機(jī)制進(jìn)行了研究，主要從以下幾部分展開： 第一部分：pshRNA-survivin表達(dá)質(zhì)粒的篩選和鑒定 目的：篩選和鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒pshRNA-survivin。 方法：重新克隆pshRNA-survivin重組質(zhì)粒后，Amp篩選陽性克隆提取質(zhì)粒DNA，用SalⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ分別酶切陽性克隆，并用相同的條件酶切載體pTZU6+1作為對(duì)照，1％瓊

2、脂糖凝膠電泳鑒定；將篩選的陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行序列分析。 結(jié)果：經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切和序列分析證實(shí)陽性克隆中含有和設(shè)計(jì)片段完全一致的序列，插入DNA片段為：TCGAGCTGAGAACGAGCCAGACTTGTTAGTACTCAAGTCTGGCTCGTTCTCAGTTITT(SUR-siRNA suqunce)，所得測(cè)序結(jié)果與GeneBank文獻(xiàn)報(bào)道的一致，未見缺失和突變，表明成功篩選和鑒定了含目的DNA片段的重組質(zhì)粒psh

3、RNA-survivin。 結(jié)論：重組質(zhì)粒pshRNA-survivin篩選和鑒定成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 第二部分：RNAi沉默TCCB細(xì)胞中survivin基因的表達(dá) 目的：觀察重組質(zhì)粒pshRNA-survivin對(duì)TCCB細(xì)胞株T24細(xì)胞中survivin基因和蛋白表達(dá)的抑制作用。 方法：將pshRNA-survivin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TCCB細(xì)胞株T24細(xì)胞，采用RT-PCR和Western blot檢測(cè)

4、T24細(xì)胞內(nèi)survivin基因和蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：pshRNA-survivin轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞后，能明顯抑制survivin基因和蛋白的表達(dá)，應(yīng)用Quantity One軟件分析結(jié)果，survivin mRNA表達(dá)抑制率達(dá)61.73％，survivin蛋白表達(dá)抑制率達(dá)53.37％。 結(jié)論：pshRNA-survivin能夠抑制T24細(xì)胞survivin基因和蛋白的表達(dá)。 第三部分：RNAi沉默survivin

5、基因?qū)24細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 目的：觀察pshRNA-survivin對(duì)T24細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響。 方法：pshRNA-survivin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TCCB細(xì)胞株T24細(xì)胞，MTT法觀察pshRNA-survivin對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用；細(xì)胞運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)psh-survivin對(duì)T24細(xì)胞的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、侵襲的抑制作用；流式細(xì)胞儀和AO/EB熒光染色法檢測(cè)T24細(xì)胞的凋亡；透射電鏡觀察T24細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變

6、化。 結(jié)果：MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組在24h、48h、72h時(shí)腫瘤抑制率分別為15.69％、27.64％和59.13％，細(xì)胞增殖受到抑制；流式細(xì)胞結(jié)果表明pshRNA-survivin組的細(xì)胞凋亡率為(16.76±1.31)％，與未轉(zhuǎn)染組凋亡率(2.82±1.44)％、空載體組凋亡率(3.59±1.23)％比較有顯著差異(P＜0.01)；AO/EB熒光染色法測(cè)定轉(zhuǎn)染24h后，未轉(zhuǎn)染組凋亡率為(2.374±1.67)％，空載體組的凋

7、亡率為(5.15±2.28)％，pshRNA-survivin組的細(xì)胞凋亡率為(14.26±2.97)％，轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組、空載體組相比較有顯著性差異(P＜0.01)，轉(zhuǎn)染48h后，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞死亡率(40.03±6.32)％和其他兩組比較差異有顯著性(P＜0.01)；細(xì)胞運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)表明pshRNA-survivin組的細(xì)胞侵襲力與運(yùn)動(dòng)能力均有顯著的降低(穿膜細(xì)胞數(shù)分別為10.34±1.85、41.32±3.47)，與未轉(zhuǎn)染組

8、(27.62±2.06、62.84±4.97)和空載體組(26.07±1.73、64.15±6.71)比較有顯著差異(P＜0.01)；透射電鏡可觀察到pshRNA-survivin組發(fā)生大量T24細(xì)胞的凋亡。 結(jié)論：當(dāng)沉默survivin基因后，T24細(xì)胞增殖受到抑制、細(xì)胞侵襲力與運(yùn)動(dòng)能力均有明顯的下降，細(xì)胞凋亡增加，提示survivin可能是TCCB生物學(xué)治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。 第四部分：RNAi沉默survivin基因

9、對(duì)TCCB裸鼠異位腫瘤生長(zhǎng)的抑制 目的：建立TCCB裸鼠異位腫瘤模型，觀察pshRNA-survivin對(duì)TCCB生長(zhǎng)抑制作用。 方法：篩選穩(wěn)定表達(dá)survivin-siRNA的膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞株(T24/survivin-siRNA)；實(shí)驗(yàn)共分3組：pshRNA-survivin轉(zhuǎn)染組、空載體組、未轉(zhuǎn)染組(每組5只)；建立裸鼠皮下種植瘤模型，觀察腫瘤形成時(shí)間，計(jì)算抑瘤率；HE染色行組織學(xué)檢查；免疫組化檢測(cè)surviv

10、in蛋白表達(dá)。 結(jié)果：pshRNA-survivin組種植瘤形成的時(shí)間顯著地延長(zhǎng)，與其它兩組比較有顯著性差異(P＜0.01)；在14d、21d，pshRNA-survivin組種植瘤體積(分別為54.19±3.81、149.54±11.49)，與未轉(zhuǎn)染組(138.40±12.44、311.02±37.01)和空載體組(167.15±13.15、338.24±19.62)比較有顯著性差異(P＜0.01)；pshRNA-surviv