RNAi技術(shù)沉默Jab1基因?qū)θ撕戆〩ep-2細(xì)胞增殖影響的研究.pdf

1、研究背景與目的:喉癌(Laryngeal Squamous Cell Carcinoma,LSCC)是耳鼻咽喉科常見(jiàn)惡性腫瘤,發(fā)病率近年來(lái)有明顯增高趨勢(shì),目前對(duì)喉癌的治療主要是手術(shù)為主,輔以放療、化療和免疫治療。但手術(shù)、放療和化療并發(fā)癥多,毒副作用大,病人的生活質(zhì)量并不高。因此尋找新的有效、簡(jiǎn)便、毒副作用小的治療方法成為眾多研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。RNA干擾(RNA interference,RNAi),也成為RNA沉默,是mRNA在雙鏈RN

2、A(double-stranded RNA,dsRNA)的介導(dǎo)下引起降解的現(xiàn)象,是生物體進(jìn)化過(guò)程中的保守機(jī)制。該技術(shù)近幾年來(lái)成為基因治療研究的熱點(diǎn)。在癌癥研究方面,它可以特異性地結(jié)合目的基因的mRNA,干擾其轉(zhuǎn)錄、翻譯形成蛋白質(zhì),抑制癌蛋白的生成,使癌細(xì)胞向成熟方向分化或誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,從而達(dá)到腫瘤基因治療的目的。喉癌和其它腫瘤一樣,其發(fā)生是一種多基因、多步驟的發(fā)生過(guò)程,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,細(xì)胞的過(guò)度增殖及凋亡受阻是其發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)外大

3、量文獻(xiàn)表明,Jab1基因在癌癥的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。Jab1即C-Jun激活區(qū)域-連接蛋白1(C-Jun activation domain-binding protein1,Jab1),是COP9信號(hào)復(fù)合體(COP9signalosome regulatory complex,COP9)的第5個(gè)亞單位,是細(xì)胞內(nèi)的可溶性蛋白,在生物體內(nèi)高度保守。細(xì)胞周期素依賴激酶抑制因子(p27kip1蛋白),是一個(gè)細(xì)胞周期負(fù)調(diào)節(jié)物,可以抑制細(xì)胞周期

4、由G1期向S期過(guò)渡。在人類腫瘤中p27kip1的變異非常少見(jiàn),p27kip1的調(diào)節(jié)主要是在在轉(zhuǎn)錄后水平,p27kip1蛋白主要在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用。在喉癌方面,國(guó)內(nèi)外有關(guān)Jab1基因的研究少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)脂質(zhì)體2000將Jab1siRNA導(dǎo)入喉癌Hep-2細(xì)胞中,使Jab1基因的表達(dá)受到抑制,并通過(guò)不同的方法來(lái)觀察Jab1siRNA對(duì)喉癌細(xì)胞Jab1基因的表達(dá)、細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　方法:1.采用免疫組化方法檢測(cè)人50例喉

5、鱗狀細(xì)胞癌組織和10例癌旁正常組織中Jab1和p27kip1的表達(dá)。
　　2.采用細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)喉癌Hep-2細(xì)胞中Jab1和p27kip1的表達(dá)。
　　3.通過(guò)Lipofectamrne2000將Jab1siRNA導(dǎo)入喉癌Hep-2細(xì)胞,抑制Jab1基因的表達(dá),通過(guò)四甲基偶氮唑藍(lán)(也成為噻唑藍(lán))光吸收法(MTT法),檢測(cè)Jab1siRNA在不同濃度、不同時(shí)間對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖的影響。
　　4.通過(guò)RT-PCR

6、法檢測(cè)Jab1 siRNA轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞后,Jab1基因和p27kip1基因的表達(dá)情況。
　　5.通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。用相同濃度的Jab1siRNAⅡ(100nm/L)轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞0、24、48、72小時(shí)后,進(jìn)行Annexin-VFITC和PI染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　6.應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用卡方檢驗(yàn)和Fisher’s精確概率法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),相關(guān)分析采用Spe

7、arman相關(guān)性分析,多樣本均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果:1.人喉鱗狀細(xì)胞癌組織免疫組化方法檢測(cè)結(jié)果:兩種蛋白的陽(yáng)性表達(dá)均為細(xì)胞核中出現(xiàn)棕褐色顆粒。Jab1在人喉鱗癌組織中高表達(dá),正常喉黏膜中不表達(dá)或弱表達(dá):p27kip1在人喉癌組織中弱表達(dá),在正常喉粘膜中強(qiáng)表達(dá);表明Jab1和p27kip1基因的表達(dá)與喉癌的發(fā)生關(guān)系密切。
　　2.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果:Jab1和p27kip1蛋白在喉癌Hep-

8、2細(xì)胞中均有表達(dá)。
　　3.RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果:在Hep-2細(xì)胞中有Jab1和p27kip1mRNA的表達(dá);Jab1siRNAⅡ可降低Jab1 mRNA表達(dá),并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),Jab1 mRNAⅡ在Hep-2細(xì)胞中的表達(dá)逐漸減弱,而p27kip1的mRNA的表達(dá)則無(wú)明顯變化。Jab1siRNAⅡ?qū)ep-2細(xì)胞Jab1基因的mRNA表達(dá)的抑制效果,比Jab1siRNAⅠ和Jab1 siRNAⅢ的抑制效果明顯。
　　4.噻

9、唑藍(lán)光吸收法(MTT)結(jié)果:Jab1siRNAⅡ轉(zhuǎn)染后的Hep-2細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比,SDH活性之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　5.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果:Hep-2細(xì)胞在Jab1 siRNAⅡ的作用下,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞凋亡率逐漸升高,差異顯著(P<0.05)。
　　結(jié)論:1.Jab1在人喉鱗癌組織中表達(dá)增強(qiáng),正常喉黏膜中不表達(dá)或弱表達(dá);p27kip1在人喉癌組織中弱表達(dá),在正常喉粘膜中強(qiáng)表達(dá);兩者在喉