結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移差異分泌蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是嚴重威脅人類健康的常見惡性腫瘤。2008年，美國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率在男、女性中均列惡性腫瘤的第三位。數(shù)十年來，隨著我國人民生活方式和膳食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率也呈逐年上升的趨勢。雖然現(xiàn)代癌癥研究和醫(yī)療技術(shù)不斷發(fā)展，結(jié)直腸癌患者的預(yù)后并沒有明顯改善。轉(zhuǎn)移是影響結(jié)直腸癌患者治療效果和導(dǎo)致死亡的主要原因。因此，研究轉(zhuǎn)移發(fā)生過程中的關(guān)鍵分子，早期預(yù)測結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移潛能，是提高結(jié)直腸癌患者生存率的關(guān)鍵。 首先

2、，我們以來自同一親本的人結(jié)直腸癌原發(fā)灶細胞株SW480和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶細胞株SW620作為體外研究的模型系統(tǒng)，通過條件的反復(fù)優(yōu)化，從這兩株細胞的無血清培養(yǎng)上清中成功的收集了高質(zhì)量的分泌蛋白樣本。 隨后，用特異性的胰酶消化蛋白質(zhì)，酶解后的肽段經(jīng)變性、脫鹽等處理后經(jīng)高效液相色譜分離，最后用FinniganTMLTQTM線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜進行分析。質(zhì)譜所采集到的原始數(shù)據(jù)用SEQUEST程序搜索國際蛋白指數(shù)(InternationalPr

3、oteinIndex，IPI)人蛋白非冗余庫(Version3.26)以鑒定蛋白質(zhì)。利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，我們從SW480和SW620細胞的分泌蛋白樣本中總共鑒定出了910個非冗余蛋白質(zhì)。由于這些蛋白質(zhì)的識別均是基于兩個及以上獨特肽段的，所以更加嚴格和可靠；據(jù)我們所知，這也是迄今為止鑒定蛋白質(zhì)數(shù)目最多的結(jié)直腸癌相關(guān)研究。 為保證后續(xù)非標記定量的質(zhì)量，我們對液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析結(jié)果的重復(fù)性和可靠性進行了評估。 結(jié)果

4、發(fā)現(xiàn)： 1、共計6次液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析的二維圖譜具有極高的相似度。 2、SW480和SW620各3次重復(fù)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析中鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)量穩(wěn)定。 3、SW480和SW620的3次實驗所識別蛋白的重復(fù)性分別為77％和74％。 4、在設(shè)定的參數(shù)下，肽段錯誤發(fā)現(xiàn)率為3.82％。證明液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析的穩(wěn)定性和重復(fù)性好，肽段鑒定的可信度較高。 在此基礎(chǔ)上，利用DeCyderTMMS差異分

5、析軟件(Version1.0)，對液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜所得的全掃描前體質(zhì)譜峰圖進行檢測、譜圖比較和定量。 所有的檢測、匹配及鑒定都在DeCyderMS的全自動模式下進行，無需手動的指定或更正。 最后采用統(tǒng)計學(xué)組間t檢驗方法，得到所有P<0.01的極顯著差異多肽分子，并搜索數(shù)據(jù)庫鑒定這些多肽分子和他們對應(yīng)的蛋白質(zhì)。通過DeCyderMS無標記定量分析，我們一共識別了145個在SW480和SW620分泌蛋白質(zhì)組中表達差異超過1.

6、5倍的蛋白。其中，75個蛋白在SW620中表達上調(diào)，而另外70個蛋白在SW620中表達下降。 這也是迄今為止最大的結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異蛋白表達譜。 在這145個差異分泌蛋白中有13個蛋白具有3個或以上的有定量信息的肽段。我們計算了這13個蛋白的肽段定量比值的變異系數(shù)，發(fā)現(xiàn)變異系數(shù)最高的為48.7％，最低的僅3.2％，平均為21％，說明我們無標記定量的準確度高，由此獲得的定量信息是可信的。 為了解這些差異分泌蛋白

7、在總體上的分子特征，我們利用多種生物信息學(xué)工具對145個差異分泌蛋白的細胞定位、生物學(xué)功能、信號通路、組織表達等進行了分析。 首先，我們使用HPRD和GO數(shù)據(jù)庫對差異分泌蛋白的細胞定位進行了分析。 發(fā)現(xiàn)：在145個差異分泌蛋白中，分泌蛋白質(zhì)組研究的興趣蛋白-胞外蛋白和膜蛋白共為62個(38個細胞外蛋白，24個膜蛋白)，占總數(shù)的42％。該比例高于目前有報導(dǎo)的同類研究中的一般水平(約30％)，說明我們對分泌蛋白的富集是成功的

8、。除13個未分類蛋白外，在145個差異分泌蛋白中有70個被歸入胞內(nèi)蛋白。為什么分泌蛋白質(zhì)組中會存在如此高比例(49％)的胞內(nèi)蛋白呢？ 我們推測，這些定位于胞內(nèi)的蛋白中至少有一部分是主動釋放至胞外的，而這種主動釋放可能通過的是胞外體(exosome)分泌途徑和非經(jīng)典分泌途徑。為明確這70個胞內(nèi)蛋白中是否確實存在非經(jīng)典分泌蛋白，我們將從IPI人蛋白非冗余庫中獲取的蛋白質(zhì)氨基酸序列信息以FASTA格式提交至非經(jīng)典分泌蛋白的預(yù)測軟件Se

9、cretomeP2.0和信號肽預(yù)測軟件SignalP3.0進行在線分析，結(jié)果中SecPscore>0.5且排除有信號肽的蛋白即被判定為非經(jīng)典分泌蛋白。最后，從70個胞內(nèi)蛋白中成功的預(yù)測出了23個(33％)非經(jīng)典分泌蛋白，證實了我們的推測。 我們利用DAVID和KEGG網(wǎng)站的分析工具獲取了差異分泌蛋白的的功能聚類和信號通路分類的重要信息。我們發(fā)現(xiàn)，這些蛋白的主要生物學(xué)功能涉及細胞分化、細胞骨架組構(gòu)、凋亡、解剖學(xué)結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生、細胞增

10、殖、細胞粘附及外部刺激反應(yīng)等方面；而肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)通路、細胞外基質(zhì)-受體相互作用通路、局部粘附通路等都存在著蛋白的富集。 這些功能和信號通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中均起著至關(guān)重要的作用，提示我們所識別的差異分泌蛋白是與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的蛋白，有可能包含重要的腫瘤標志物。利用WebGestalt網(wǎng)站提供的組織表達分析工具，我們還識別了25個在結(jié)腸高特異性表達的差異分泌蛋白，它們有成為結(jié)直腸癌特異性標志物的潛能。

11、從145個差異分泌蛋白中，我們選擇了7個(TFF3、GDF15、AGR2、LASP1、TGM2、LCN2和IGFBP7)進行熒光定量PCR分析和Westernblot驗證。熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，7個蛋白中，除了LASP1，其余6個的mRNA表達的變化趨勢均與質(zhì)譜定量的結(jié)果一致。對細胞培養(yǎng)上清和細胞裂解液中差異分泌蛋白的Westernblot檢測顯示： 在培養(yǎng)上清中，7個蛋白的相對表達變化均與質(zhì)譜定量結(jié)果完全一致，這就直接證明了

12、我們質(zhì)譜分析結(jié)果的可靠性。 在細胞裂解液中，TFF3、AGR2、GDF15、TGM2和LCN2的相對表達也與質(zhì)譜定量結(jié)果一致，說明這些蛋白分泌增加可能是合成增加的結(jié)果。但是，LASP1在細胞裂解液中的表達卻呈現(xiàn)出與質(zhì)譜定量以及上清中檢測結(jié)果相反的變化，而與前面PCR結(jié)果一致。 所以，我們推測：LASP1存在合成和分泌不一致的情況。即在mRNA和總蛋白水平上，LASP1在SW620細胞中的表達較SW480細胞下調(diào)，但其在S

13、W620細胞中分泌量卻顯著增加，從而使其在SW620細胞培養(yǎng)上清中表達上調(diào)。當然，為何會出現(xiàn)蛋白合成與分泌不一致的現(xiàn)象，在SW620細胞中，LASP1又是通過什么機制而分泌增加的，還不得而知，需要后續(xù)的實驗研究。此外，我們發(fā)現(xiàn)，雖然IGFBP7在SW480細胞的培養(yǎng)上清中有較強的表達，卻未能在細胞裂解液中檢測到其表達，推測該蛋白可能在合成后即迅速、完全的釋放到胞外。 這些在結(jié)直腸癌原發(fā)灶細胞株SW480和轉(zhuǎn)移灶細胞株SW620之

14、間存在差異表達的分泌蛋白可否成為結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的血清標志物呢？這是我們最為關(guān)注的問題。 為此，我們選擇了兩個在SW620中表達上調(diào)的分泌蛋白-TFF3和GDF15進行了更深入的研究。首先，我們用免疫組織化學(xué)的方法檢測了TFF3與GDF15在38例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌(每例均有原發(fā)灶和配對的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié))和31例無轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌中的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TFF3和GDF15的陽性染色主要定位于癌細胞的胞漿中。 其中，TFF

15、3在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達水平略強于無轉(zhuǎn)移組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.157)；但是，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中TFF3的免疫組織化學(xué)染色明顯強于其配對的原發(fā)灶(P<0.0001)。GDF15的表達在無轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌原發(fā)灶和配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中依次增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。提示TFF3和GDF15表達與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。相關(guān)分析還發(fā)現(xiàn)GDF15與TFF3在結(jié)直腸癌中的表達有低度相關(guān)性(r=0.241；P=0.046)。此外，

16、TFF3的表達水平與腫瘤部位有關(guān)，結(jié)腸癌中TFF3染色強度顯著高于直腸癌(P=0.007)；其與性別、年齡、腫瘤大小、分級、TNM分期等臨床病理參數(shù)無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性(P>0.0.5)。與TFF3不同，GDF15的表達與TNM分期有關(guān)，TNM分期III/IV期的結(jié)直腸癌GDF15表達水平顯著高于I/II期(P<0.0001)；其與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、組織學(xué)類型、分級等臨床病理參數(shù)之間無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性。 利用雙抗夾心ELIS