熊果酸抗實(shí)驗(yàn)性肝纖維化作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：肝纖維化是指肝臟炎癥或直接毒性損傷后所引起的以肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積過(guò)多為特征的一類(lèi)慢性肝病。研究表明，肝纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的病變，但臨床上至今缺乏確切有效的抗肝纖維化藥物與方法。近幾年研究發(fā)現(xiàn)我國(guó)的中草藥具有良好的抗肝纖維化療效。本研究根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀及我們的前期工作基礎(chǔ)，將熊果酸作用于二甲基亞硝胺(DMN)誘導(dǎo)的肝纖維化實(shí)驗(yàn)大鼠，研究熊果酸對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝纖維化的治療作用及作用機(jī)制，為肝纖維化治療提供新的治療方案。

2、 目的：通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察熊果酸對(duì)肝纖維化大鼠肝功能、肝臟組織病理學(xué)的影響；并通過(guò)觀察熊果酸抗氧化作用、對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)及其抑制因子-1(TIMP-1)mRNA表達(dá)以及對(duì)α-SMA蛋白表達(dá)的影響，探討熊果酸抗肝纖維化的可能作用機(jī)理。 方法：采用1％DMN溶液(1ml/kg)給予大鼠腹腔注射誘導(dǎo)肝纖維化模型，正常對(duì)照組給予生理鹽水1ml/kg腹腔注射，每周連續(xù)3天，造模4周。造模結(jié)束后將大鼠隨機(jī)分組并開(kāi)始每天腹腔

3、給藥，正常對(duì)照組和模型組予以生理鹽水1ml/kg/d；秋水仙堿組用量為0.1mg/kg/d；熊果酸高、中、低劑量組用量分別為10mg/kg/d、20mg/kg/d、40mg/kg/d。分別在藥物治療2周、4周采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)各組大鼠血清ALT、AST、ALB、A/G。藥物治療4周后肉眼觀察各組大鼠肝臟大體表現(xiàn)；HE觀察肝小葉結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞壞死程度及纖維組織增生程度；VG染色觀察膠原纖維增生程度，并用半定量標(biāo)準(zhǔn)判斷膠原纖維增生程度；采用

4、TBA法檢測(cè)血清SOD、MDA的含量；RT-PCR方法檢測(cè)MMP-1mRNA、TIMP-1mRNA的表達(dá)；Westernblot方法檢測(cè)α-SMA蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1、DMN誘導(dǎo)的模型組與正常對(duì)照組相比大鼠血清肝功能指標(biāo)ALT、AST的含量均明顯升高，ALB、A/G含量下降(P<0.01)；各劑量熊果酸和秋水仙堿作用肝纖維化大鼠2周、4周后，同時(shí)間點(diǎn)熊果酸各劑量組ALT、AST相比模型組明顯降低，ALB、A/G則明顯

5、升高(P<0.05，P<0.01)：秋水仙堿組對(duì)A/G無(wú)明顯影響，余作用介于熊果酸低劑量組與熊果酸中劑量組之間且無(wú)時(shí)間依賴(lài)性。 2、肉眼觀察模型組大鼠肝臟增大，顏色淺，邊緣鈍，質(zhì)地硬，表面有粗顆粒狀表現(xiàn)，與周?chē)鞴僬尺B廣泛；肉眼觀察熊果酸各劑量組和秋水仙堿組肝臟有明顯改善。HE染色模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、肝細(xì)胞壞死明顯、間質(zhì)細(xì)胞大量彌漫增生、纖維組織增生明顯，形成肝纖維化；VG染色模型組匯管區(qū)見(jiàn)大量膠原纖維，膠原纖維構(gòu)成的纖維間隔

6、形成，肝竇內(nèi)連續(xù)或斷續(xù)性環(huán)狀膠原沉積，肝臟組織膠原纖維增生程度與正常對(duì)照組比較明顯升高(P<0.01)。HE染色熊果酸各劑量組和秋水仙堿組各組肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)改善，肝細(xì)胞壞死和纖維組織增生明顯減輕；VG染色熊果酸各劑量組和秋水仙堿組膠原纖維增生明顯減輕，熊果酸中、高劑量組與模型組、秋水仙堿組比較肝臟組織膠原纖維增生程度明顯下降(P<0.05，P<0.01)。 3、模型組SOD表達(dá)值為(124.73±19.79)U·ml-1，較正

7、常對(duì)照組SOD(176.79±26.69)U·ml-1明顯降低(P<0.01)；而模型組MDA表達(dá)值(66.44±6.51)nmol·ml-1，較正常對(duì)照組：MDA(7.95±0.97)nmol·ml-1明顯升高(P<0.01)；熊果酸高、中、低劑量組和秋水仙堿組SOD表達(dá)值分別為(154.29±15.39)U·ml-1、(201.22±3.38)U·ml-1、(245.74±37.24)U·ml-1、(128.45±10.06)U·m

8、l-1，熊果酸各劑量組均比模型組顯著升高(P<0.01)，秋水仙堿組與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MDA表達(dá)值分別為(26.69±4.75)nmol·ml-1、(14.38±0.48)nmol·ml-1、(10.50±1.44)nmol·ml-1、(42.02±6.29)nmol·ml-1，相比模型組顯著降低(P<0.05，P<0.01)，熊果酸各劑量組與秋水仙堿組之間MDA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 4、模型組MMP-

9、1 mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯降低(P<0.01)，而模型組TIMP-1mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.01)；熊果酸各劑量組和秋水仙堿組MMP-1 mRNA的表達(dá)較模型組升高(P<0.01)，而TIMP-1mRNA表達(dá)較模型組降低(P<0.05,P<0.01)；熊果酸中、高劑量組相比秋水仙堿組MMP-1mRNA的表達(dá)顯著升高(P<0.01)，而熊果酸各劑量組相比秋水仙堿組TIMP-1mRN,A的表達(dá)顯著降低(P<0.0

10、1，P<0.05)。 5、模型組α-SMA蛋白的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.01)；熊果酸各劑量組α-SMA蛋白的表達(dá)較模型組明顯降低(P<0.01)；秋水仙堿組與模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，熊果酸各劑量組相比秋水仙堿組α-SMA蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.01，P<0.05)。 結(jié)論： ①熊果酸具有改善肝纖維化作用，表現(xiàn)在熊果酸可降低ALT、AST，升高ALB、A/G，從而明顯改善肝纖維化大鼠肝功能；HE染色

11、示熊果酸可改善肝小葉結(jié)構(gòu)，明顯減輕肝細(xì)胞壞死和纖維組織增生，VG染色示熊果酸可明顯減少膠原纖維的沉積，降低肝臟組織膠原纖維增生程度；熊果酸的綜合作用明顯強(qiáng)于秋水仙堿且本實(shí)驗(yàn)熊果酸劑量以40mg/kg/d作用最為顯著，優(yōu)于熊果酸10mg/kg/d、20mg/kg/d劑量組。 ②熊果酸抗肝纖維化的可能作用機(jī)制表現(xiàn)在：1)通過(guò)增加SOD的表達(dá)、降低MDA表達(dá)來(lái)阻斷氧化應(yīng)激過(guò)程、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化；2)通過(guò)上調(diào)MMP-1mRNA表達(dá)、下調(diào)T