原子力顯微鏡對大腸癌細(xì)胞株形貌特征的研究.pdf

1、[研究背景]
　　 大腸癌(CRC)是發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤之一，在世界最常見惡性腫瘤中列第四位，死亡率已躍居惡性腫瘤第二位，在我國惡性腫瘤中列第三位。由于對大腸癌的早期診斷率相對較低，發(fā)現(xiàn)時多處于中晚期，術(shù)后易發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，因此對于大腸癌的早期診斷成為了近年來研究的重點。
　　 目前，在腫瘤的形態(tài)學(xué)診斷方面仍然依靠病理科醫(yī)師個人經(jīng)驗和對腫瘤細(xì)胞的識別能力，缺乏客觀判定指標(biāo)和數(shù)據(jù)。因此，探討一種新的、能夠觀察其形貌特

2、征、更客觀、更準(zhǔn)確、更早地識別癌前病變和早期癌細(xì)胞學(xué)改變的方法和技術(shù)，具有重要的學(xué)術(shù)價值和臨床意義。
　　 原子力顯微鏡(AFM)是一種具有納米級或亞納米級的超高分辨率、能對細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)和機械性能進(jìn)行精確成像的分析儀器。它是由Binning等在1986年由掃描隧道顯微鏡的基礎(chǔ)之上研制而成的，并在當(dāng)時獲得了諾貝爾物理學(xué)獎。其所具有其他顯微技術(shù)所不具備的成像優(yōu)勢：1.可以觀察到的標(biāo)本范圍非常廣泛，標(biāo)本可以是金屬、半金屬及絕緣體等，

3、都可以用原子力顯微鏡進(jìn)行觀察；2.具有極高的分辨率，能清晰地觀測到原子分子的形貌結(jié)構(gòu)及力學(xué)特征；3.成像環(huán)境要求低，既可在空氣中成像，也可在其他的環(huán)境中成像；4.成像時間短，可及時準(zhǔn)確的得到標(biāo)本的三維形貌圖；5.探針如得到修飾以后可用于判別特定的分子及其相互的作用力，因此近年來被廣泛應(yīng)用于包括臨床醫(yī)學(xué)在內(nèi)的各個領(lǐng)域，特別是觀察腫瘤細(xì)胞的機械性能與超微結(jié)構(gòu)方面，顯示出其良好的應(yīng)用前景。但目前對于大腸癌細(xì)胞株的形貌學(xué)特征的觀察研究鮮見報道。

4、
　　 [研究目的]
　　 本研究通過普通光鏡和原子力顯微鏡對比觀察大腸癌細(xì)胞株HT-29（HT-29）和耐5-FU的大腸癌細(xì)胞株HCT-8/5-FU（HCT-8/5-FU）的形貌學(xué)改變；對比觀察經(jīng)過5-FU處理、不同階段的HT-29和HCT-8/5-FU兩組細(xì)胞株的動態(tài)形貌學(xué)特征；探討原子力顯微鏡在大腸癌細(xì)胞形貌學(xué)檢測方面的應(yīng)用價值，對比分析普通光學(xué)顯微鏡下主觀判斷的腫瘤形態(tài)學(xué)改變與原子力顯微鏡所分析的客觀數(shù)值間的相關(guān)

5、性。為癌前病變及大腸癌的早期病理形態(tài)學(xué)診斷探索新途徑；為應(yīng)用化療藥物后根據(jù)大腸癌細(xì)胞形貌學(xué)改變判定耐藥與否等提供一個新思路。
　　 [研究方法]
　　 本實驗分為三個部分：
　　 1.采用細(xì)胞印片法和細(xì)胞爬片法分別對正常大腸上皮細(xì)胞和大腸癌細(xì)胞株HT-29進(jìn)行制片，然后利用倒置相差顯微鏡和原子力顯微鏡對比觀察正常大腸上皮細(xì)胞和大腸癌細(xì)胞株HT-29的細(xì)胞形貌學(xué)特征。
　　 2.通過細(xì)胞培養(yǎng)及耐藥株的建立(

6、HCT-8/5-FU)，采用細(xì)胞爬片法制片，利用倒置相差顯微鏡及原子力顯微鏡對HT-29和HCT-8/5-FU兩組細(xì)胞株的形貌特征進(jìn)行對比觀察。
　　 3.采用5ug/ml5-FU分別處理大腸癌細(xì)胞株HT-29和HCT-8/5-FU2h和6h后，利用倒置相差顯微鏡及原子力顯微鏡對應(yīng)用化療藥物處理后不同時段兩組細(xì)胞的形貌特征進(jìn)行對比觀察。
　　 [研究結(jié)果]
　　 1.普通光鏡下觀察大腸正常上皮細(xì)胞與大腸癌細(xì)胞株H

7、T-29，只能看到形狀及大小不同，沒有客觀數(shù)值。原子力顯微鏡掃描分析結(jié)果：大腸癌細(xì)胞株HT-29細(xì)胞直徑25.684±6.265、平均粗糙度94.800±11.375、平均峰高度11.764±3.278、平均凹陷程度-24.863±8.386及表面積差值2.511±1.254;大腸正常上皮細(xì)胞：直徑11.482±2.314、平均粗糙度13.105±6.307、平均峰高度7.827±2.673、平均凹陷程度-18.837±7.265、表面

8、積差值1.894±0.675;兩組有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，可量化評估。
　　 2.普通光鏡下觀察大腸癌細(xì)胞株HT-29和耐藥株HCT-8/5-FU,只能看到形狀及大小不同，沒有客觀數(shù)值。原子力顯微鏡掃描分析結(jié)果：耐藥株HCT-8/5-FU細(xì)胞直徑30.175±5.247、平均粗糙度98.750±10.460、平均峰高度16.856±2.673、平均凹陷程度-30.524±7.265及表面積差值5.278±1.175;

9、大腸癌細(xì)胞株HT-29細(xì)胞直徑25.684±6.265、平均粗糙度94.800±11.375、平均峰高度11.764±3.278、平均凹陷程度-24.863±8.386及表面積差值2.511±1.254;兩組有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，可量化評估。
　　 3.普通光鏡下觀察經(jīng)5-FU處理2、6小時后大腸癌細(xì)胞株HT-29和耐藥株HCT-8/5-FU細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞大小輕度改變，沒有客觀數(shù)值。原子力顯微鏡掃描分析結(jié)果：大

10、腸癌細(xì)胞株HT-29在0h、2h、6h的動態(tài)觀察過程中，細(xì)胞直徑25.684±6.265、31.356±5.018、49.073±4.147，平均粗糙度94.800±11.375、98.175±10.269、115.234±9.656，平均峰高度11.764±3.278、15.678±2.768、26.359±2.051，平均凹陷程度-24.863±8.386、-29.476±6.712、-35.317±6.018，表面積差值2.511

11、±1.254、2.959±0.976、6.768±0.873五個客觀數(shù)值均有明顯改變(P＜0.05)；而耐藥株HCT-8/5-FU細(xì)胞經(jīng)5-FU處理0h，2h、6h后，細(xì)胞直徑30.175±5.247,31.979±4.317、35.073±4.205，平均粗糙度98.750±10.460，99.265±9.475、101.670±9.015，平均峰高度16.856±2.673，17.569±2.113、19.478±1.964，平均凹

12、陷程度-30.524±7.265，-31.263±6.055、-32.456±5.798，表面積差值5.278±1.175,5.924±1.013、6.567±0.927五個客觀數(shù)值比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。此外，兩種細(xì)胞株在5-FU處理0h和6h的細(xì)胞直徑、平均粗糙度、平均峰高度、平均凹陷程度及表面積差值五個客觀數(shù)值比較有顯著差異(P＜0.05);5-FU處理2h的五個客觀數(shù)值兩組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　

13、 [研究結(jié)論]
　　 1.原子力顯微鏡掃描觀察正常大腸上皮細(xì)胞和大腸癌細(xì)胞株HT-29的細(xì)胞形貌學(xué)特征，可以得出客觀數(shù)值（普通光學(xué)顯微鏡所觀察不到的、精細(xì)的形貌特征數(shù)據(jù)），有助于量化判定細(xì)胞的良惡性。提示原子力顯微鏡形貌學(xué)觀察可以用于大腸癌細(xì)胞的客觀判定。
　　 2.原子力顯微鏡形貌學(xué)特征量化分析非耐藥株HT-29與耐藥株HCT-8/5-FU精細(xì)的形貌學(xué)特征，有助于從形貌學(xué)改變判別耐藥與否。
　　 3.原子力顯