轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的增強(qiáng)子捕獲技術(shù)在斑馬魚上初步應(yīng)用.pdf

1、轉(zhuǎn)座子(Transposon，Tn)，存在于生物界的各種生物基因組中，是一段可以在基因組上自由移動(dòng)并改變其位置的DNA序列。轉(zhuǎn)座子天然具有基因轉(zhuǎn)移特性，可作為基因載體用于基因組遺傳修飾。Sleeping Beauty(SB)、PiggyBac(PB)和Tol2等三種轉(zhuǎn)座子目前被廣泛應(yīng)用于脊椎動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究構(gòu)建基因突變體庫，研究基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理及表達(dá)特性。本研究利用自行構(gòu)建的SB、PB和To12介導(dǎo)的增強(qiáng)子捕獲載體制備了增強(qiáng)子捕獲斑馬魚，

2、比較報(bào)告基因和捕獲的增強(qiáng)子及內(nèi)源基因時(shí)空表達(dá)模式，以期獲得調(diào)控組織發(fā)育或細(xì)胞分化的特異性增強(qiáng)子。主要獲得以下研究結(jié)果:
　　1、根據(jù)不同熒光表型將SB、PB及To12介導(dǎo)的增強(qiáng)子捕獲轉(zhuǎn)基因斑馬魚F1代進(jìn)行分類，選擇具有典型表達(dá)模式的個(gè)體建立7個(gè)品系，分別為SK-1、SK-3、SK-6、SK-12、TK-1、TK-4及PK-0。將7個(gè)品系分別與野生型交配產(chǎn)生F2代，觀察其胚胎早期不同發(fā)育階段綠色熒光蛋白表達(dá)模式，結(jié)果表明7個(gè)品系熒光

3、表型主要分為:腦、軀干、眼睛、心臟、下頜等。以F2代基因組為模板進(jìn)行SP-PCR及測(cè)序結(jié)果表明，捕獲載體分別插入整合在基因組不同位點(diǎn)分布在5個(gè)不同染色體;共捕獲了7個(gè)不同的內(nèi)源基因(slc9a8、ednraa、mettl22、wdr33、dlx1a、rps26和itgav)，其中4個(gè)插入位點(diǎn)位于內(nèi)含子，1個(gè)位于外顯子，2個(gè)分別位于基因上游20Kb和下游10bp處。
　　2、利用內(nèi)源基因反義RNA作為探針進(jìn)行斑馬魚胚胎原位雜交，結(jié)果

4、表明在24hpf和48hpf兩個(gè)發(fā)育階段，內(nèi)源基因與報(bào)告基因綠色熒光蛋白表達(dá)模式大體一致。腦、眼及全身等熒光信號(hào)強(qiáng)的組織其雜交后著色也較深。
　　綜上所述，本研究表明，三種轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的增強(qiáng)子捕獲載體均能有效應(yīng)用于增強(qiáng)子捕獲。報(bào)告基因和內(nèi)源基因可能在相同增強(qiáng)子調(diào)控下表達(dá)，綠色熒光信號(hào)基本可代表內(nèi)源基因的時(shí)空表達(dá)特性。本研究可為增強(qiáng)子注解提供重要參考，為進(jìn)一步研究增強(qiáng)子表達(dá)調(diào)控功能及基因活性奠定基礎(chǔ)，對(duì)后基因組時(shí)代的研究具有重要的意義